Immunobiocapteurs à transduction électrochimique et-ou optique pour la détection de toxines planctoniques et de pesticides

• Auteur / Autrice : Christophe A. Marquette
• Direction : Loïc Blum
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences. Biochimie
• Date : Soutenance en 1999
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Loïc Blum

Mots clés

Mots clés contrôlés

Enzymes immobilisées

Électroluminescence

Chimiluminescence

Immunocapteurs

Acide okadaïque

2,4-D (herbicide)

Détecteurs de produits chimiques

Résumé

Le travail presente dans ce manuscrit est divise en deux parties. La premiere est focalisee sur la caracterisation du systeme analytique, i. E. Un systeme de detection/transduction et un support d'immobilisation, le plus performant pour le developpement d'immunocapteurs en flux continu. La seconde partie est dediee a l'etude de l'electrochimiluminescence (ecl) du luminol et a son application au developpement de biocapteurs electrochimiluminescent. Deux molecules ont ete utilisees pour l'etude d'immunocapteurs : un herbicide, l'acide 2,4-dichlorophenoxyacetique (2,4-d) et une toxine planctonique, l'acide okadaique (oa). Dans une premiere etude, le 2,4-d est utilise comme molecule cible afin de comparer les performances de deux systemes de detection, l'electrochimiluminescence du luminol et la chimiluminescence (cl) catalysee par la peroxydase. La reaction ecl, declenchee par une electrode de carbone vitreux polarisee a + 425 mv vs pt (pseudo-reference), permet une detection tres sensible du luminol et d'anticorps marques par le luminol. Neanmoins, malgre cette sensibilite, l'immunocapteur cl est apparu etre le plus performant avec une detection du 2,4-d possible sur la gamme 0,2 g/l - 200 mg/l. Cette etude a ete menee en utilisant l'electrode de carbone elle meme comme support d'immobilisation. Ce systeme est apparu stable et regenerable mais dans des conditions relativement difficiles (une etape de sonication). Afin de solutionner ce probleme, les etudes se sont dirigees vers la recherche d'un support d'immobilisation minimisant l'adsorption non-specifique des anticorps et permettant une regeneration aisee de l'antigene immobilise. Ces caracteristiques ont ete reunies avec un nouveau type de membranes preactivees (ultrabind t m). Ces dernieres sont utilisees pour le developpement d'un immunocapteur pour la detection de l'oa dans des tissus de moules. Dans ce cas, les membranes d'antigene immobilise sont stables et regenerables par simple application d'une solution chaotropique. Cet immunocapteur est alors utilise afin de comparer une detection chimiluminescente et un troisieme systeme de transduction, l'amperometrie, base sur l'activite d'anticorps marques par la glucose oxydase (god). Comme attendu, l'immunocapteur cl s'est avere le plus performant avec une limite de detection de 0,1 g/l, obtenue en 20 minutes, alors que l'obtention de cette limite de detection necessite 50 minutes avec le systeme amperometrique. De plus, l'immunocapteur cl a pu etre totalement integre dans un systeme a flux continu. Lorsque ce systeme analytique est applique a la detection du 2,4-d, les performances de l'immunocapteur apparaissent egalement satisfaisantes pour un temps de mesure de 20 minutes. Les immunocapteurs cl utilisant les membranes ultrabind t m semblent donc les plus performants pour l'immunodetection rapide de molecules de faible poids moleculaire. La detection electrochimiluminescente du luminol s'est averee tres sensible. Cette reaction permet egalement de detecter une seconde molecule, le peroxyde d'hydrogene. Cette opportunite est utilisee dans cette deuxieme partie afin d'etudier deux biocapteurs en flux continu bases sur l'immobilisation de la glucose oxydase et de la lactate oxydase. La haute sensibilite de la detection du peroxyde d'hydrogene, de 1,5 pmol a 27,5 nmol, nous a permis d'obtenir des limites de detection respectivement de 60 et 150 pmol pour les biocapteurs a lactate et a glucose. De plus, l'utilisation de ces biocapteurs pour des dosages dans des matrices complexes telles que du serum humain ou du petit lait nous a permis de demontrer l'absence d'interferences dues a ces matrices. Ces mesures en milieu complexe presentent une bonne correlation avec les methodes de references et sont stables lors d'utilisations repetees des biocapteurs (40-60 essais sur 20 heures).