Contribution de l'amplification génique (PCR) au diagnostic de la toxoplasmose : intérêts de la PCR quantitative

• Auteur / Autrice : Patrick Beauchamps
• Direction : Marie-France Cesbron-Delauw
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance en 1999
• Etablissement(s) : Lille 1

Mots clés

Mots clés contrôlés

Toxoplasmose

Toxoplasma gondii

PCR (génétique)

Amplification génique

Résumé

La toxoplasmose est une parasitose ubiquitaire occupant une large place en médecine humaine et vétérinaire. Cette affection parasitaire très fréquente en France est le plus souvent bénigne voire asymptomatique. Pourtant, elle reste redoutable en situation de transmission congénitale. De même, sa survenue chez les malades immunodéprimés a radicalement changé la conception de cette maladie. Pour compenser les insuffisances du sérodiagnostic et du diagnostic parasitologique, nous avons mis au point un diagnostic permettant un dépistage très précoce face à la suspicion d'une toxoplasmose congénitale ou cérébrale. Ce diagnostic repose sur l'amplification spécifique d'un gène répété 35 fois de Toxoplasma gondii (gène B1) associé à un système de révélation par chimioluminescence. A partir de prélèvements comparables aux liquides amniotiques humains, nous sommes capables de détecter spécifiquement un tachyzoïte. Nous avons également mis au point un modèle de PCR quantitative sur ADN utilisant un standard interne compétitif et spécifique des gènes SAGl, B1 et ARN 18S. Ce modèle est applicable à tout modèle d'étude expérimental où la quantification d'une charge parasitaire est nécessaire. Nos premiers essais ont porté sur la quantification d'une charge parasitaire cérébrale (kyste, souche Prugniaud) dans un modèle murin (BALB/C et C57 BI/6) d'encéphalite toxoplasmique. Afin de documenter une éventuelle corrélation entre l'expression des gènes de granules denses et la virulence des différentes souches du parasite, nous avons élaboré l'ensemble des outils techniques d'un modèle de RT-PCR quantitative pour le gène GRA2 (gène reconnu être impliqué dans le pouvoir pathogène). Ce système utilise une molécule standard interne compétitive, différente de 4 paires de bases comparée à la cible génomique. Les produits PCR marqués à la fluorescéine par nested-PCR, seront quantifiés à l'aide d'un analyseur automatique d'ADN. Les variations de rendement d'amplification seront quant à elles, corrigées par la quantification d'un gène rapporteur (bêta-tubuline).