Fidelite et terminaison de la polymerisation avec les transcriptases inverses in vitro

• Auteur / Autrice : VALERIE DERRIEN
• Direction : CLAUDE REISS
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1998
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

Les transcriptases inverses (rt) forment une classe speciale d'enzymes replicatives, du fait de leur processivite et fidelite faibles. Nous avons etudie les mecanismes responsables de la fidelite et processivite faibles chez trois rt virales (hiv, amv et momlv) et le fragment de klenow (kf), avec un fragment d'adn, forme de la region hypervariable v1 du gene env de hiv, complete aux deux extremites par les deux amorces naturelles de la rt de hiv, ppt et pbs (sous forme adn). L'analyse des sites de terminaison montre que : la prochaine base a incorporer est preferentiellement une pyrimidine ; la sequence adn en aval est contrainte en certaines bases, la sequence matrice en amont presente une tendance a l'autoappariement. L'effet des amorces est remarquable : contrairement a l'elongation a partir de ppt, avec pbs, les terminaisons sont nombreuses. Le remplacement de l'un des dntp naturels par un dntp de base modifiee (i, u, c7a et c7g) montre que ces dntp sont acceptes comme substrats et donnent lieu a des terminaisons generalement plus frequentes, selon la base, le site et l'enzyme. La fidelite a ete determinee en l'absence de l'un des dntp. A l'inverse de la processivite, la fidelite est, en general, bonne avec pbs, et mediocre avec ppt. Ce type de mutation n'est donc pas correle avec la terminaison. L'analyse des misincorporations de bases normales ou d'analogues montre que ces substitutions sont compatibles avec des appariements de type wobble. La structure tridimensionnelle de la rt de hiv nous a permis de faire une modelisation expliquant la terminaison et l'introduction des differents types d'erreur. Ce modele s'articule autour de trois points : les 5 bases precedant l'extremite 3oh de l'amorce sont en conformation a, l'existence d'un coude important a la jonction entre les conformations a et b de l'adn db et la flexibilite de l'enzyme. Ce modele souligne le role de la conformation de la double-helice adn, dependant de la composition en bases, a la fois sur la terminaison et la fidelite.