Etude par mutagenese dirigee de l'activation par la lumiere de la malate-deshydrogenase a nadp de sorgho

Study of light-activation of nadp-malate dehydrogenase by site-directed mutagenesis

• Auteur / Autrice : Eric Ruelland
• Direction : Myroslawa Miginiac-Maslow
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1998
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

La malate deshydrogenase a nadp est une enzyme chloroplastique qui a la caracteristique d'etre totalement inactive a l'obscurite et active a la lumiere. Cette activation correspond a la reduction de l'enzyme par les electrons de la chaine de transfert photosynthetique via le systeme ferredoxine/thioredoxine. Des resultats anterieurs ont montre que 4 cysteines situees dans des extensions n- et c- terminales specifiques des mdh photomodulees etaient impliquees dans ce processus. Un modele d'activation a alors ete propose, selon lequel dans des conditions oxydantes l'enzyme possede deux ponts disulfures par sous-unite, situees dans les extensions de sequence. L'extension c-terminale bloque l'acces au site actif. En presence de thioredoxines reduites, le pont n-terminal est reduit, suite a quoi le site actif subit un changement de conformation conduisant a site de fixation pour l'oxaloacetate de haute affinite et a une activite catalytique plus grande. L'extension c-terminale est egalement reduite par les thioredoxines, ce qui a pour consequence le deplacement de l'extension qui ne bloque plus alors l'acces au site actif. Dans cette etude, le role des 4 cysteines conservees internes a ete etudie. Des experiences de mutagenese ont permis de proposer un modele d'activation en deux etapes faisant intervenir une isomerisation du pont 24-29 en 24-207. La seconde partie de ce travail a consiste a etudier comment l'extension c-terminale bloque l'acces au site actif dans l'etat oxyde. En continuant a utiliser une approche par mutagenese dirigee, les deux derniers residus c-terminaux ont ete identifies comme ceux ancrant l'extension c-terminale dans le au site actif. La synergie entre la reduction du pont n-terminal et la reduction du pont c-terminal a aussi ete etudiee. Ainsi, ces resultats representent les premieres preuves moleculaires que l'absence totale d'activite de la nadp-malate dehydrogenase dans des conditions oxydantes est en partie due a une inhibition intrasterique. Finalement, le role essentiel des arginines du site actif a ete demontre en mutant ces residus en glutamine ou aspartate. Les proteines obtenues montraient une importante perte d'activite.