Etude des sites de liaison des antagonistes peptidiques linéaires du récepteur V1a de la vasopressine par une approche de marquage covalent et de mutagénèse dirigée

Study of linear peptidic antagonist-binding sites of the v1a vasopressin receptor using photoaffinity labeling and site-directed mutagenesis

• Auteur / Autrice : Sylvie Phalipou
• Direction : Claude Barberis
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie moléculaire
• Date : Soutenance en 1998
• Etablissement(s) : Montpellier 2

Mots clés

Mots clés contrôlés

Molécules -- Modèles

Mutagenèse

Marquage par photoaffinité

Antagonistes

Récepteurs

Vasopressine

Résumé

Ce travail a pour objectif d'etudier le site de liaison des antagonistes du recepteur v#1#a humain de la vasopressine. Nous avons cartographie les zones d'interaction des antagonistes peptidiques lineaires avec le recepteur v#1#a de facon directe par la technique de marquage de photoaffinite. Nous avons developpe, caracterise pharmacologiquement et fonctionnellement deux analogues photoactivables de l'avp : le #1#2#5i3n#3phpa-lva et le #1#2#5ilys(3n#3phpa)#8ho-lva. Les recepteurs v#1#a exprimes dans les cellules cho sont photomarques de facon specifique par ces ligands et sont observes sur gel sds-polyacrylamide sous la forme de deux proteines glycosylees radioactives de 85-90 kda et 46 kda. Celle de 46 kda resulte du clivage de la proteine de 85-90 kda par une protease presente dans la preparation membranaire des cellules. Afin de delimiter les zones de contact entre le recepteur et ses ligands, l'espece proteique de 46 kda photomarquee par le #1#2#5i3n#3phpa-lva a ete fragmentee par les proteases v8 et/ou lys-c. L'identite du plus petit fragment photomarque (poids moleculaire de 6 kda) issu de la digestion par la protease v8, a ete verifiee par mutation des sites de clivage de l'enzyme. Nous avons conclu que le #1#2#5i3n#3phpa-lva se lie de facon covalente au recepteur v#1#a humain dans la region du septieme domaine transmembranaire (asn#3#2#7ile#3#4#7). De meme, la proteine de 46 kda photomarquee par le #1#2#5ilys(3n#3phpa)#8ho-lva a ete fragmentee chimiquement (bromure de cyanogene) et/ou enzymatiquement (proteases lys-c et asp-n). Le plus petit fragment photomarque a un poids moleculaire de 2,5 kda et represente la premiere boucle extracellulaire du recepteur (asp#1#1#2pro#1#2#0). A l'aide de ces resultats, nous proposons un modele d'interaction de ces ligands avec le recepteur v#1#a humain. Le positionnement des deux ligands dans la poche de liaison du recepteur est similaire a celui de l'avp, ces ligands lineaires adoptant le meme type de conformation que les ligands cycliques.