Recherche Avancée

Thèse soutenue

Isolement et caractérisation d'un gène d'Arabidopsis codant pour une polynucléotide phosphorylase putative interagissant avec TBP (Tata-binding protein)

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Auteur / Autrice : Yeon-Jung Kim
Direction : Régis Mache
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biologie
Date : Soutenance en 1998
Etablissement(s) : Université Joseph Fourier (Grenoble ; 1971-2015)

Résumé

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L'arn polymerase ii, l'enzyme core responsable de la synthese des arnm chez les eucaryotes, exige des facteurs supplementaires pour l'initiation de la transcription (facteurs generaux de transcription : tfiia, tfiid, tfiif, tfiie, tfiih et tfiij). L'assemblage du complexe d'initiation de la transcription au niveau des elements promoteurs debute par le recrutement du facteur tfiid, qui est un facteur d'initiation essentiel constitue de la proteine de liaison a la boite tata (tbp) et de plusieurs facteurs associees a tbp. Ces derniers sont appeles tafs et certains semblent agir egalement comme coactivateurs qui modulent la regulation transcriptionnelle en interagissant avec divers activateurs ou represseurs transcriptionnels. Le but de ce travail consistait a rechercher des proteines qui interagiraient avec la proteine tbp2 d'arabidopsis. Les connaissances actuelles concernant la composition du complexe d'initiation de la transcription par l'arn polymerase ii etaient limitees aux systemes humains, de drosophiles ou de levures. Peu d'information etait disponible concernant le systeme vegetal a l'exception de certaines proteines tbp isolees chez quelques especes. Nous avions utilise le systeme double hybride de la levure pour cribler une banque d'adnc d'a. Thaliana et un clone positif a ete finalement isole. L'adnc ainsi isole a ete introduit dans un vecteur d'expression d'e. Coli pour une surproduction de la proteine sous forme de fusion a la gst. L'analyse de l'interaction proteine-proteine in vitro en utilisant la proteine (tip : tbp interacting polypeptide) surexprimee et la proteine cible tbp fusionnee a un enchainement d'histidine a confirme l'interaction directe entre tip et tbp. Une experience de gel retard a prouve que tip empeche tbp2 de se lier a la boite tata in vitro. Afin de trouver le gene et l'adnc complet, une banque genomique et une deuxieme banque d'adnc ont ete criblees avec le fragment d'adnc precedemment isole comme sonde. Un fragment d'adn d'approximativement 7 kb contenant le gene entier, et un adnc, codant une proteine d'environ 110 kda, ont ete obtenus et sequences. La comparaison de sequence utilisant le logiciel blast a revele une forte homologie avec la pnpase d'e. Coli (polynucleotide phosphorylase) au niveau du domaine n-terminal de la proteine. Mais le domaine c-terminal contenant l'activite de liaison a tbp ne montre aucune similitude particuliere avec d'autres proteines. Nous avons montre, par co-immunoprecipitation, que cette proteine complete interagit avec tbp in vitro. En outre, le resultat d'une analyse de rnase protection indique que le gene est transcrit constitutivement en un arnm presentant un intron non episse (retention d'intron). Cet arnm incompletement episse semble coder pour la proteine tronquee, ce qui est du a la presence de codons stop dans l'intron. L'epissage de cet intron semble etre regule de facon tissu-specifique et par des stress environnementaux : c'est a dire que l'arnm completement episse est trouve seulement dans les graines et les siliques et dans les plantes traitees au froid. Base sur l'ensemble des resultats, l'implication de la proteine ainsi identifiee dans la regulation de l'expression des genes est discutee.