Etude cinétique du mode d'action de l'alpha-amylase pancréatique de porc : mise en évidence de sites fonctionnels d'attachement de ligands

Kinetic study of mechanism of porcine pancreatic -amylase ; evidence for two functional ligand-binding sites

• Auteur / Autrice : Modhafar Al Kazaz
• Direction : Antoine Puigserver
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie. Nutrition, aspects moléculaires et cellulaires
• Date : Soutenance en 1998
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Enzymes

Pancréas

Porc

Acarbose

Amylose

Cinétique enzymatique

Résumé

L'-amylase est presente chez les animaux, les plantes, les champignons et les bacteries. Elle catalyse l'hydrolyse des liaisons osidiques internes, -1,4, dans l'amidon, l'amylose, l'amylopectine et les maltodextrines. L'amidon est l'un des principaux nutriments de l'alimentation du porc. Le processus de digestion chez le porc est tres semblable a celui de l'homme. Les structures 3-d des amylases de pancreas de porc (app) et de pancreas humain sont tres proches. L'app (pm : 55 400) est une enzyme en tonneau (domaines a et b, 1-404) contenant un domaine c-terminal distinct (405-496) organise en feuillets. Le mecanisme d'action de l'app est cependant mal connu. Notre etude a pour objet de comprendre plus avant la fonction de l'app et les rapports structure-fonction. Trois substrats de longueurs differents ont ete testes : l'amylose dp 420, la maltodextrine dp18 reduite (r-maltodextrine) et le maltopentaose. Les vitesses initiales ont ete determinees en mesurant les coupures (reductometrie) ou la concentration des produits de la reaction (systeme dionex). L'acarbose, un pseudotetrasaccharide, est un puissant inhibiteur des glucosidases utilise pour le traitement du diabete mellitus et l'obesite. Les cinetiques d'inhibition des deux isoformes de pancreas de porc app i et app ii ont ete effectuees utilisant l'amylose, la r-maltodextrine et le maltopentaose. Les vitesses ont ete mesurees a diverses concentrations de substrat en presence et en l'absence d'une concentration fixee d'acarbose. Les traces de lineweaver-burk donnent des droites de pentes et d'ordonnees a l'origine croissantes. Ces traces indiquent, selon les regles de cleland, une inhibition non-competitive mixte. Les traces secondaires correspondants sont differents selon le type de substrat utilise : les traces obtenus pour la r-maltodextrine et maltopentaose sont lineaires, ceux obtenus pour l'amylose sont paraboliques. Au vu de ces resultats un modele reactionnel simple, indiquant des complexes abortifs, est propose. Les equations de vitesse, de pente et d'ordonnee a l'origine ont ete calculees, elles sont en excellent accord avec les courbes experimentales. Ces resultats ont ete confirmes par l'analyse de dixon. Ils nous permettent de postuler que dans l'inhibition de l'hydrolyse du maltopentaose et de la r-maltodextrine, une molecule d'acarbose est liee par molecule d'amylase tandis que dans le cas de l'hydrolyse de l'amylose deux molecules d'acarbose sont attachees. Les sites determines par l'analyse cinetique pourrait correspondre aux sites surface determines par cristallographie. Dans notre modele ces sites additionnels d'attachement des carbohydrates deviennent fonctionnels apres fixation du substrat au site actif de l'enzyme. L'analyse cinetique de l'inhibition excercee par le maltose et le maltotriose, produits de l'hydrolyse du maltopentaose, a ensuite ete realisee. L'inhibition par le maltose est de type non-competitif tandis que celle excercee par le maltotriose est competitif. On peut donc conclure que le premier produit libere lors de l'hydrolyse du maltopentaose est du maltose. Il est donc clair que le fragment situe du cote de l'extremite reductrice est libere en premier lieu. En conclusion, aucune difference significative entre app i et app ii n'a ete observee, ceci suggere l'existence de formes multiples de l'enzyme (isoformes). Un mecanisme general d'action de l'app est propose : en plus du site actif de substrat a longue chaine necessiterait le site d'attachement glucose et le site maltose determines par cristallographie tandis que un seul site serait necessaire pour l'hydrolyse des substrats a chaine courte.