Thèse soutenue

Contribution à l'étude du rôle des hydrogénases de Desulfovibrio fructosovorans : l'hydrogénase à fer dimérique

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Auteur / Autrice : Laurence Casalot
Direction : Jean-Pierre Belaich
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Sciences
Date : Soutenance en 1998
Etablissement(s) : Aix-Marseille 1

Résumé

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Desulfovibrio fructosovorans possede trois hydrogenases (hyds), une a nife, une nadp-dependante et une a fer dimerique. La purification partielle de cette derniere hyd nous a permis de sequencer les extremites n-terminales de ses sous-unites. Les genes de structure hydab ont ete isoles par pcr directe et inverse. Dans la region n-terminale, la grande sous-unite presente deux sites analogues aux sites de coordination des centres 4fe/4s des ferredoxines. Dans la region c-terminale, sept cys conservees pourraient permettre la coordination du site actif. Dans la region en amont de l'operon hydab, une region fortement conservee entre les trois hyds dimeriques de desulfovibrio pourrait etre impliquee dans un processus de regulation. La construction, pour la premiere fois, d'une souche totalement depourvue d'activite hyd nous a permis d'envisager une etude pour preciser le role de ces hyds dans le metabolisme energetique. Le double mutant, depourvu des hyds a nife et nadp-dependante, presentait une perturbation au niveau de la phosphorylation oxydative. La souche deletee en plus des genes hydab ne presente plus le meme phenotype. En effet, lors de croissances realisees sur lactate, fructose ou pyruvate/sulfate, le triple mutant presente les memes rendements que la souche sauvage. Ces resultats indiquent que la synthese d'atp, bien que plus lente, se fait avec la meme efficacite que dans la souche sauvage. De plus, la souche, bien que in vitro depourvue de toute activite hyd, reste capable de croitre sur h#2/sulfate/acetate. Afin de mieux comprendre ces phenotypes, nous avons tente complementer le triple mutant. Pour cela, nous avons tout d'abord construit des vecteurs capables de se repliquer chez la bsr et chez e. Coli afin de simplifier le clonage. Ces vecteurs navettes sont porteurs des genes de resistance a differents antibiotiques. Nous avons donc introduit sur le plasmide pbms7 (resistance a la streptomycine) les genes de structure de l'hyd a fer. Le plasmide recombinant obtenu, ps7hf, a ete introduit dans d. Fructosovorans et l'hyd a fer a de nouveau ete mise en evidence dans la souche complementee. Nous disposons donc a present d'outils genetiques qui nous permettront de poursuivre les etudes au niveau des hyds de d. Fructosovorans dans le but de mieux cerner leur role dans le metabolisme energetique de cette souche.