Purification des immunoglobulines G humaines et de leurs sous classes à l'aide de colorants immobilisés et d'anticorps monoclonaux

Purification of human igg subclasses by affinity chromatography on immobilized dyes and specific subclass monoclonal antibodies

• Auteur / Autrice : M'Hammed Hasnaoui
• Direction : Olivier Bertrand
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance en 1997
• Etablissement(s) : Paris 13

Mots clés

Mots clés contrôlés

Chromatographie

ELISA

Résumé

Chez l'homme, des deficits isoles en sous classes d'igg (igg1, 2, 3 ou 4) sont a l'origine de graves infections a repetitions. Grace a la chromatographie sur colorants immobilises et l'utilisation anticorps monoclonaux (amc), nous avons tente de mettre au point des techniques qui permettent de purifier les differentes sous classes d'igg. D'autres auteurs avaient montre que des colorants immobilises et particulierement le rubinol r/k-5bl, pouvait retenir avec une grande affinite les immunoglobulines par leur fragment fc. Par criblage systematique des conditions d'elution, nous avons trouve des substances capables d'eluer les immunoglobulines d'une colonne de ce colorant dans des conditions non denaturantes (un melange inositol hexa phosphate et imidazole). Nous avons montre que l'affinite importante de ce colorant pour les igg est due a la presence d'un atome de cuivre dans sa structure. Par ailleurs, nous avons crible par chromatographie frontale plus de 80 colorants pour leurs affinites relatives vis a vis des sous classes d'igg et plus particulierement des igg2. Parmi les colorants les plus capacitifs pour l'ensemble des sous classes d'igg, un colorant, le jaune procion he-4r a une plus forte affinite pour les igg1 que les igg2. Nous l'avons utilise pour mettre au point une technique d'enrichissement en igg2. Nous avons teste par chromatographie zonale, les conditions optimum d'enrichissement des igg2 sur ce colorant. Finalement grace a deux passages sur ce colorant, et l'elution par augmentation de ph puis l'elution par un gradient d'ihp, nous avons obtenu des fractions enrichies a 67% en igg2 (avec un rendement de purification de 43%). Par ailleurs, plusieurs amc diriges contre les isotypes des igg humaines ont ete obtenus par la technique des hybridomes. Quatre de ces amc ont ete selectionnes pour leur faculte a detecter chacun une des quatre sous-classes par une technique elisa utilisant un panel de proteines myelomateuses purifiees. Ces memes amc ont ete testes quant a leur capacite a immunopurifier en une seule etape une des sous-classes d'igg a partir des preparations d'igg purifiees ou de serum humain. Ainsi nous avons obtenu des preparations d'igg1, d'igg3 et d'igg4 enrichies respectivement a 83%, 65% et 87%. En conclusion, l'ensemble des sous classes d'igg peut etre purifie soit avec des amc en ce qui concerne les igg1, igg3 et igg4, soit avec le colorant jaune procion he-4r en ce qui concerne les igg2