Utilisation de l'arn polymerase de t7 chez escherichia coli : synthese, traduction et stabilite des transcrits

Using t7 rna polymerase in e. Coli cells : synthesis, translation and stability of the transcripts

• Auteur / Autrice : PASCAL JEAN LOPEZ
• Direction : Marc Dreyfus
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1997
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

Chez les procaryotes la synthese et la traduction des arnm ont lieu simultanement et a la meme vitesse : c'est le couplage transcription-traduction. Pour etudier le role de ce couplage nous avons exploite les proprietes de l'arn polymerase (arnp) de t7 qui est 8 fois plus rapide que celle d'e. Coli. Nous avons construit des souches exprimant outre l'arnp de t7, un gene d'interet place sous le controle soit d'un promoteur de t7 (p#t#7) soit d'un promoteur de e. Coli, et suivi d'un arnt utilise ici comme rapporteur transcriptionnel. Nous montrons que p#t#7 est le plus fort promoteur connu chez e. Coli, mais que ses transcrits sont instables, vraisemblablement a cause de la presence d'une region depourvue de ribosomes derriere l'arnp. En outre, nous avons compare les frequences de transcription a partir de p#t#7 in vitro et in vivo. In vitro, l'arnp de t7 est connue pour realiser des cycles de transcription abortive sur la sequence initiale (its) avant d'entrer en phase processive. Lorsque cette its differe du consensus ou lorsqu'on utilise des mutants lents de cette arnp, l'etape de transcription abortive se prolonge jusqu'a devenir limitante dans le processus de transcription. Nous avons montre que ces facteurs affectent d'une facon similaire la transcription in vivo, suggerant l'existence d'une transcription abortive in vivo. De plus, nous montrons qu'une proteine obstructrice comme le represseur lactose ou une autre polymerase, peuvent bloquer l'elongation de l'arnp de t7, mais uniquement lorsque cette proteine est fixee sur l'its. Nous proposons que la proteine obstructrice ralentit localement l'arnp en augmentant les k#m pour les nucleotides, ce qui favorise la transcription abortive. Enfin, nous avons etudie l'effet d'inhibiteurs de la traduction sur la stabilite de deux arn non-traduits chez e. Coli. Nous montrons que ces arn sont stabilises par l'addition de ces drogues, probablement via l'inhibition d'un complexe multiproteique associant une activite exo-et endonucleolytique.