Les metaux, nouveaux elements de structure des adenyl kinases bacteriennes

Structural role of zinc in bacterial adenylate kinases

• Auteur / Autrice : Véronique Perrier
• Direction : Anne-Marie Gilles
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1997
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

L'adenyl kinase (ak) possede un role majeur dans le maintien du reservoir des nucleotides a adenine puisque c'est le seul enzyme capable de recycler l'amp produit dans le metabolisme cellulaire. Nos etudes anterieures ont mis en evidence, dans l'ak de bacillus stearothermophilus (ak#s#t), la presence d'un atome de zinc chelate par 4 cysteines a la maniere d'un motif en doigt de zinc. L'examen d'une trentaine d'especes bacteriennes a permis de montrer que ce metal est un element structural commun aux adenyl kinases des bacteries gram-positif. L'etude des alignements de sequences d'aks nous a conduits a developper trois sujets pour comprendre le role de ces metaux chez ces proteines:(i) la fixation du zinc est correlee chez la plupart des aks avec le motif cys-x#2-cys-x#1#6-cys-x#2-cys ou le residu cys en derniere position peutt etre remplace par un residu asp dans l'ak de b. Subtilis. Une etude approfondie de cette proteine a montre que la chelation du zinc est compatible avec ce residu asp, illustrant la variabilite des residus qui fixent le zinc chez ces enzymes ; (ii) la sequence consensus qui permet la chelation du zinc chez les aks de bacteries gram positif n'existe pas chez les aks de bacteries gram negatif et est remplacee par une autre, tres conservee his-x#2-ser-x#1#6-asp-x#2-thr. Nous avons entrepris de creer, par mutagenese dirigee, un quadruple mutant de l'ak d'e. Coli en remplacant les residus his, ser, asp et thr (hsdt) par quatre cysteines (cccc) afin d'engendrer un site de fixation de metal. L'ak recombinante d'e. Coli (c#4) a acquis la capacite de fixer le zinc et montre un gain de thermostabilite d'environ 12c, tout en conservant les proprietes catalytiques de l'enzyme sauvage. (iii) l'ak de p. Denitrificans est la seule ak de bacteries gram negatif a posseder un motif structural proche des aks de bacterie gram positif: his-x#2-cys-x#1#6-cys-x#2-cys. Pour approfondir le role de celui-ci dans l'eventuelle fixation de metaux, le clonage du gene adk de cette bacterie a ete entrepris. La proteine recombinante surproduite chez e. Coli est un dimere, qui fixe a la fois du zinc et du fer. La diversite structurale des aks bacteriennes par rapport aux enzymes eucaryotes, pourrait etre mise a profit dans la recherche d'inhibiteurs specifiques des aks de bacteries pathogenes