Clonage de genes codant pour des adn-polymerases d'archaea provenant de sources hydrothermales abyssales. Synthese, purification et etude des enzymes recombinants

• Auteur / Autrice : Marie-Anne Cambon-Bonavita
• Direction : ANDRE KLIER
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques fondamentales et appliquées. Sciences médicales
• Date : Soutenance en 1997
• Etablissement(s) : Paris 7

Résumé

Dix nouveaux isolats de la famille des thermococcales, disponibles dans les collections de l'ifremer et du cnrs, ont ete selectionnes dans le cadre d'un programme de recherche de nouveaux genes codant pour des adn polymerases thermostables. Pyrococcus abyssi et pyrococcus profondus ont ete selectionnes dans un premier temps. Thermococcus fumicolans a ete retenu sur la base d'hybridations adn-adn faibles avec les souches thermococcus litoralis et thermococcus celer. La strategie de clonage retenue repose sur la possibilite d'utiliser les sequences publiees des genes correspondants de t. Litoralis et p. Furiosus. Des sondes ont ete synthetisees par pcr et hybridees avec l'adn des trois isolats. Les genes de p. Abyssi et p. Profondus sont tres proches et ne presentent pas de sequence d'insertion. Par contre le gene de t. Fumicolans est interrompu par deux sequences d'insertion (ivs) au sein des motifs a et c. Ces sequences ont ete utilisees dans une optique de taxonomie moleculaire. Les trois genes, avec les deux ivs dans le troisieme cas, ont ete amplifies par pcr puis clones dans des vecteurs d'expression de la famille t7. Apres synthese proteique, les enzymes ont ete purifies en plusieurs etapes : lyse cellulaire, thermodenaturation puis des chromatographies echangeuses d'ions ou d'affinite. La caracterisation preliminaire de leurs proprietes a ete realisee. - l'etude de la thermostabilite des enzymes montre que, malgre un taux de similarite eleve entre les sequences polypeptidiques, leur comportement est different. Le temps de demi-vie de l'enzyme pab (de p. Abyssi) est de deux heures a 105\c contre deux heures a 100\c pour l'enzyme ppr (de p. Profondus), comme c'est le cas pour l'enzyme tfu (de t. Fumicolans). - les enzymes pab et ppr ne presentent pas d'activite 3-5 exonuclease et leur fidelite lors d'amplification est relativement faible. Par contre l'enzyme tfu presente une activite 3-5 exonuclease. Cette activite est moins thermostable que pour l'enzyme vent (de t. Litoralis) mais elle est moins sensible a la concentration en dntp dans le milieu. - l'aptitude des trois enzymes a etre utilises en pcr a aussi ete etudiee. Les enzymes pab et ppr sont d'usage aise, resultat de l'absence d'activite 3-5 exonuclease. L'enzyme tfu permet un rendement d'amplification moindre mais probablement avec un taux d'erreur plus faible. Ce dernier point est actuellement en cours d'etude.