La bothrojaracine : clonage, séquencage, expression et études fonctionnelles

• Auteur / Autrice : Véronique Arocas
• Direction : Martine Jandrot-Perrus
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1997
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Thrombine

Expression génique

Mots clés libres

Bothrops jararaca

Inhibiteur

Thrombine

Anticoagulant

Site fixation

Venin

Interaction moleculaire

Expression genique

Gène

Séquence nucleotide

Lectine

Proteine recombinante

Bothrojaracine

Résumé

La bothrojaracine est un inhibiteur spécifique de la thrombine, enzyme clef de la coagulation. C'est une protéine de 27 KDA isolée du venin de Bothrops Jararaca par Zingali et coll. Et constituée de deux chaînes polypeptidiques. La bothrojaracine n'interagit pas avec le site catalytique de l'enzyme mais bloque plusieurs de ses fonctions : coagulation du fibrinogène, activation plaquettaire, liaison à la fibrine et à la thrombomoduline. Nous montrons que la liaison de la thrombine à la bothrojaracine immobilisée est de haute affinité (KD = 0. 7 nm) et implique au moins deux sites de la thrombine : l'exosite 1, spécialisé dans la reconnaissance de protéines cibles, et l'exosite 2 ou site de liaison de l'héparine. L'effet inhibiteur de la bothrojaracine s'exerce également sur la thrombine liée aux caillots de fibrine et résulte en partie d'un déplacement de la thrombine liée. La bothrojaracine inhibe également l'activation du facteur V par les traces de thrombine formées à la phase initiale de la coagulation et limite ainsi la génération massive de thrombine. De plus, nos résultats montrent que l'exosite 1 de la thrombine est essentiel pour la reconnaissance du facteur V par la thrombine, alors que l'exosite 2 ne joue pas de rôle. Nous avons cloné la bothrojaracine à partir d'une banque d’ADNc de glandes a venin et détermine que les deux chaînes sont codées par des ARNM distincts. Leur coexpression par transfection transitoire a permis l'obtention de bothrojaracine recombinante active. La séquence de la bothrojaracine indique qu'elle appartient à une vaste famille de protéines de venin apparentées aux lectines de type c, dont elle est la première à avoir été exprimée. Dans l'ensemble, nos résultats montrent que la bothrojaracine possède un mécanisme d'action original. Sa haute affinité pour la thrombine, sa liaison à la prothrombine, et sa capacité à inhiber la thrombine liée à la fibrine suggèrent qu'elle pourrait être un antithrombotique efficace.