Le role de la structure quaternaire de la nucleoside diphosphate kinase dans son activite catalytique et sa capacite a interagir avec les acides nucleiques

The role of the quaternary structure of the nucleoside diphosphate kinase for its catalytic activity and its dna binding property

• Auteur / Autrice : SEBASTIEN MESNILDREY
• Direction : Michel Véron
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1997
• Etablissement(s) : Paris 7

Résumé

La nucleoside diphosphate kinase (ndp kinase) est une proteine ubiquitaire composee, chez les eucaryotes, de six sous-unites de 17 a 20 kda. Cette enzyme catalyse le transfert du phosphate d'un nucleoside triphosphate vers un nucleoside diphosphate via un intermediaire phospho-enzyme. En plus de son role dans le metabolisme des nucleotides, la ndp kinase est impliquee dans d'autres fonctions cellulaires comme le developpement chez la drosophile ou la proliferation cellulaire chez l'humain. Par des techniques d'immuno-fluorescence, la presence de la ndp kinase b a pu etre mise en evidence dans le cytoplasme mais aussi dans le noyau de cellules humaines. Cette enzyme, qui est capable de se fixer sur le promoteur de l'oncogene c-myc et d'activer sa transcription, possede des proprietes de liaison a divers oligonucleotides, avec une meilleure affinite pour les sequences d'adn simple brin riches en pyrimidines. J'ai etudie le role de la structure quaternaire dans les differentes activites de la ndp kinase de dictyostelium. Apres avoir modifie par mutagenese dirigee plusieurs residus impliques dans les contacts entre sous-unites, j'ai obtenu une proteine mutante dimerique, p100s-n150stop, depourvue d'activite enzymatique. En presence de nucleotide substrat, cette proteine se reassocie en hexameres ayant des proprietes cinetiques identiques a celles de l'enzyme sauvage alors que la proteine mutante dimerique est incapable de s'autophosphoryler. La reassociation en hexamere fait apparaitre un intermediaire transitoire phosphorylable mais peu actif. L'ensemble de ces resultats demontre que l'activite catalytique est portee exclusivement par la forme hexamerique. Alors que l'enzyme sauvage de dictyostelium n'interagit pas avec l'adn, la forme dimerique est capable de former un complexe adn/proteine. De meme, pour la ndpk-b humaine, cette fonction est dependante de l'etat oligomerique. Ces resultats supportent l'hypothese selon laquelle les differents etats oligomeriques de la ndp kinase sont responsables de fonctions cellulaires differentes.