Études physiologique et moléculaire de la réponse au stress osmotique chez Sinorhizobium meliloti : caractérisation des gènes impliqués dans la biosynthèse et le transport de la glycine bétaïne

Physiological and molecular analysis of osmotic responses in Sinorhizobium meliloti : characterization of genes involved in glycine betaine biosynthesis and transport

• Auteur / Autrice : Éric Boncompagni
• Direction : Daniel Le Rudulier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie
• Date : Soutenance en 1997
• Etablissement(s) : Nice
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université de Nice-Sophia Antipolis. Faculté des sciences
• Jury : Président / Présidente : François Cuzin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marie-Thérèse Esquerré-Tugayé, André-France Klier
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jacques Batut, Erhard Bremer

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biologie moléculaire

Translocation (génétique)

Bioaccumulation

Biosynthèse

Choline

Luzerne

Symbiose

Sinorhizobium meliloti

Mots clés libres

Sciences biologiques fondamentales et appliquées

Physiologie végétale et développement

Agronomie, sciences du sol et production végétale

Medicago sativa

Nodosité végétale

Choc osmotique

Osmorégulation

Glycinebétaïne

Biologie moleculaire

Résumé

L'accumulation intracellulaire de la glycine bétaïne chez S. Meliloti est obtenue par deux mécanismes distincts : soit un transport de choline exogène suivi d'une oxydation en deux étapes impliquant la glycine bétaïne aldéhyde comme intermédiaire, soit un transport actif de la glycine bétaïne exogène. La caractérisation moléculaire du système de biosynthèse (locus betICBA) et d'un système de transport (locus proU) fait l'objet de ce travail. Le locus bet comprend quatre gènes organisés en opéron : betI code une protéine régulatrice, betC une choline sulfatase qui permet l'utilisation de la choline-O-sulfate comme précurseur de la choline, betB une betaïnal déshydrogénase et betA une choline déshydrogénase. Si des protéines homologues à betI, betB et betA ont déjà été identifiées chez E. Coli, betC est caractérisé pour la première fois. La choline-O-sulfate est une source potentielle de carbone, d'azote et de soufre pour la bactérie. La construction de mutants, par insertion de cassette Ω et du transposon Tn5, et de fusions transcriptionnelles lacZ a été réalisée. In vitro, la choline et la choline-O-sulfate exogènes induisent spécifiquement l'expression de betA et de betB. Des études, in planta, montrent aussi une expression de ces fusions au cours des différentes étapes du processus de nodulation, dans les cordons d'infection et dans la zone active de fixation de l'azote chez les nodosités matures. La recherche des systèmes de biosynthèse, de transport et de catabolisme de la glycine bétaïne a été étendue à d'autres Rhizobiacées. La bétaïne joue un rôle primordial comme source nutritionnelle et, plus accessoirement, comme molécule osmoprotectrice chez la plupart des espèces étudiées, à l'exception de Bradyrhizobium japonicum. Le clonage d'un système de transport de la glycine bétaïne de type ABC (proU-like) a été réalisé par l'utilisation d'une approche PCR. La protéine ATPasique ProV, la plus conservée, présente 55 % d'identité avec la protéine équivalente d'E. Coli ; toutefois, elle est nettement plus courte (275 acides aminés au lieu de 400). La protéine périplasmique ProX est la moins conservée ; la taille et le point isoélectrique calculés sont conformes aux valeurs obtenues expérimentalement. La protéine hydrophobe ProW, montre une délétion des 50 premiers acides aminés par rapport aux protéines du même type. La présence d'autres systèmes de transport de la glycine bétaïne n'a pas permis de mettre en évidence une réduction de l'osmotolérance des mutants présentant des insertions de cassette Ω dans chacun des gènes du locus ProU. Ce locus, comme le locus bet, est situé sur le chromosome et non sur les mégaplasmides pSym. Enfin, des mutations dans ces régions n'affectent ni la capacité de nodulation, ni l'activité fixatrice d'azote des plantes hôtes.

In medium of elevated osmolarity, the growth of S. Meliloti is strongly enhanced by addition of glycine betaine (1 mM). In opposition to E. Coli and B. Subtilis, S. Meliloti uses glycine betaine as an osmoprotectant, as well as a carbon and nitrogen source. Intracellular accumulation of glycine betaine is obtained through two distincts mechanisms: either a choline uptake followed by a two-step oxidation with glycine betaine aldehyde as an intermediate or an active glycine betaine uptake. The molecular characterization of both systems, biosynthesis (locus betICBA) and transport (locus proU) is presented here. The bet locus contains four genes within an operon: betI encodes a regulatory protein, betC encodes a choline sulfatase, enzyme involved in the conversion of choline-O-sulfate into choline, betB encodes a betainal dehydrogenase and betA encodes a choline dehydrogenase. Proteins homologuous to BetI, BetB and BetA have been previously identified in E. Coli, but Bet C is charactezied for the first time. Choline-O-sulfate can be used as carbon, nitrogen and sulfur sources by S. Meliloti. Construction of Tn5 and Ω insertion mutants and transcriptional lacZ fusions were realized. In vitro, exogenous choline and choline-O-sulfate are strong inducers of betA and betB expression. In planta studies also shows expression of thes fusions during the nodulation process, in infection threads and in active nitrogen-fixing zone of mature nodules. Biosynthesis, transport, and catabolism of glycine betaine were investigates within other Rhizobia. Except Bradyrhizobium japonicum, most of the studied species can use glycine betaine as an energy source for growth and, in some cases, as an osmoprotective molecule. A PCR approach was used to clone an ABC transport system (proU-like) involved in glycine betaine uptake. The more conserved protein, ProV (ATPase) show 55 % identity with the E. Coli ProV; however,, this protein is much shorter in S. Meliloti (275 amino acids instead of 400 in E. Coli). The periplasmic protein Pro Xis the less conserved; its calculated molecular weight and pHi are in good agreement with experimentally determines values. The hydrophobic protein ProW shows a 50 amino acid deletion compared to other homologous proteins. Insertions of Ω cassette into the different genes of the proU locus do not lead to reduced osmotolerance because of the presence of other glycine betaine uptake systems. This locus, and the bet locus, are located on the bacterial chromosome and not on pSym megaplasmids. Mutations within these loci do not modify neither nodulation capacity nor plant host nitrogen fixation activity.