Etude cinétique de la fermentation glutamique par corynebacterium glutamicum et caractérisation physiologique par cytométrie en flux

• Auteur / Autrice : Florence Debay
• Direction : Jean-Marc Engasser
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologies et industries alimentaires
• Date : Soutenance en 1997
• Etablissement(s) : Vandoeuvre-les-Nancy, INPL

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cytométrie de flux

Corynebacterium glutamicum

Gluten

Résumé

Les objectifs généraux de ce travail sont d’une part d’étudier les paramètres qui permettent d’orienter le métabolisme de Corynebacterium vers la synthèse d’acide glutamique après l’ajout du surfactant et d’autre part de caractériser les perturbations physiologiques subies par les cellules au moment de la transition entre le métabolisme de croissance et le métabolisme de production de l’acide glutamique. Dans un premier temps, un milieu synthétique a été mis au point permettant l’obtention d’une concentration finale de glutamate de 85 g/l tout en favorisant les études physiologiques et métaboliques. L’étude de la fermentation glutamique a ensuite permis de mettre en évidence et d’étudier l’influence de paramètres clefs. En effet, cette culture nécessite, d’une part une oxygénation importante de façon à éviter la formation de lactate et d’autre part, une concentration élevée en glycine-bétaïne dans le milieu indispensable pour obtenir de fortes concentrations en acide glutamique. Enfin, la pression osmotique s’est avérée être le paramètre le plus intéressant. En effet, une pression osmotique du milieu pied de 1200 mosm. Kg-1 s’est avérée optimale pour la production de glutamate. Dans une deuxième partie, l’utilisation de la cytométrie en flux a permis d’étudier des fonctions cellulaires particulièrement affectées par l’ajout du surfactant : le potentiel de membrane, le pH intracellulaire et la viabilité bactérienne. En particulier, le surfactant agit directement sur le potentiel de membrane. Celui-ci diminue rapidement après l’addition du surfactant. Plus la quantité de surfactant ajoutée pour une certaine quantité de cellules est importante plus la diminution du potentiel de membrane est prononcée. De plus, cette étude a montré que le pH intracellulaire diminuait continuellement tout au long de la phase de production ainsi que la viabilité quand celle-ci était évaluée selon l’activité des estérases intracellulaires et l’intégrité membranaire. La cytométrie en flux s’est donc avérée être un outil intéressant pour la compréhension des phénomènes intervenant au milieu cellulaire au cours de la fermentation glutamique

The aims of this work were to study the parameters which induce the orientation of the metabolism of Corynebacterium glutamicum towards glutamate production and the characterize the physiological events following Tween auddition. In a first part, a performant synthetic medium was developed to achieve high concentration of glutamic acid : 85 g/l. We investigated the effect of severals important parameters. Indeed, this culture needs high oxygenation in order to avoid lactate production and high glycine betaine concentration in order to obtain high production of glutamate. Finally, we showed that osmotic pressure was the most interesting factor. It has been found that an intermediate initial osmotic pressure, around 1200 mosm. Kg-1 led to a maximal final concentration of glutamic acid. In the second part, flow cytometry has been used to study cellular physiology. It has been shown that membrane potential, intracellular pH and viability were strongly subjected to the addition of surfactant. For example, surfactant was found to directly act on membrane potential. Tween addition led to an immediate decrease of membrane potential. Besides, we observed that membrane potential decrease raised in proportion to the amount of Tween added. Besides, intracellular pH decreased continuously all over the glutamate producing phase as well as esterases activity and membrane intergrity. In conclusion, flow cytometry represents a good tool for the understanding of the physiology of coryneform bacteria producing glutamic acid