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Thèse soutenue

Études fonctionnelles et structurales de l'asparaginyl-ARNt synthétase de Thermus thermophilus

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Auteur / Autrice : Laurence Seignovert
Direction : Reuben Leberman
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biologie
Date : Soutenance en 1997
Etablissement(s) : Université Joseph Fourier (Grenoble ; 1971-2015)

Résumé

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Le gene d'une aminoacyl-arnt synthetase de classe iib, l'asparaginyl-arnt synthetase (asns) de thermus thermophilus hb8 a ete clone et sequence. Ce gene code pour une proteine de 438 acides amines. L'usage des codons du gene asns est similaire a l'usage caracteristique des genes des bacteries du genre thermus, ou le genome a un contenu en g+c de 67%. La composition en acides amines montre un changement dans la frequence d'utilisation de certains acides amines comparee aux proteines mesophiles. Ces changements pourraient expliquer la stabilite thermique des proteines de cet organisme. L'expression du gene asns de t. Thermophilus chez e. Coli a permis de surproduire et de purifier simplement l'enzyme thermostable. Les etudes biochimiques realisees sur la proteine recombinante montrent une thermostabilite remarquable ; l'enzyme garde 50% de son activite initiale d'aminoacylation apres 1h d'incubation a 90c ou 21h a 85c. Des cristaux de l'enzyme ont ete obtenus a partir de solution de peg 6000. Une etude par diffraction aux rayons x a permis de resoudre la structure tridimensionnelle de la premiere asparaginyl-arnt synthetase a 2. 75 a de resolution. L'analyse structurale montre de fortes similarites avec les deux autres enzymes de classe iib, l'aspartyl-et la lysyl-arnt synthetases. Cette analyse confirme la sous-classification des aars basee sur des comparaisons de sequences. Une etude par diffraction aux rayons x des cristaux de proteine complexee a son substrat, atp ou a l'intermediaire de la reaction, l'asparaginyl-adenylate a permis d'elucider les mecanismes utilises par ces aminoacyl-arnt synthetases pour assurer la specificite et la discrimination des substrats lors de la premiere etape de la reaction d'aminoacylation. La derniere partie de ce travail a ete la determination de la sequence codante pour l'arnt#a#s#n de t. Thermophilus. L'arnt#a#s#n a alors ete surproduit par transcription in vitro. Les premiers tests d'aminoacylation indiquent que le transcrit est fonctionnel.