Identification d'une protéine du tonoplaste impliquée dans les échanges d'acide malique entre vacuole et cytoplasme chez Catharanthus roseus L

Identification with a photoaffinity reagent of a tonoplast protein involved in vacuolar malate transport of catharanthus roseus l

• Auteur / Autrice : KARIM LAHJOUJI
• Direction : Hervé Canut
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire végétale
• Date : Soutenance en 1996
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Résumé

L'acide malique joue un role essentiel dans le metabolisme de la cellule vegetale. Cet acide organique est ainsi tres largement distribue dans tous les organites. Sa compartimentation intracellulaire met en jeu divers transporteurs membranaires et canaux ioniques. En vue de l'identification de la proteine transporteur tonoplastique du malate des cellules de catharanthus roseus l. , un analogue photoactivable, l'acide n- (4-azido salicylyl) aspartique a ete synthetise. Cet analogue inhibe competitivement le transport du malate dans des vesicules de tonoplaste (k#i=1,7 mm). L'analogue radioactif (iodation) est egalement inhibiteur competitif et a permis de visualiser apres sds-page et autoradiographie le marquage de plusieurs polypeptides. Cependant, seul le marquage d'un polypeptide, de masse moleculaire de 37 kda disparait lorsque le substrat malate (25 mm) est present dans le milieu reactionnel. Le diethylpyrocarbonate, inhibiteur du transport de malate agissant au niveau du site actif du transporteur, protege egalement le polypeptide de 37 kda vis-a-vis du photomarquage. Citrate et quinate presentent egalement des proprietes protectrices ; a l'inverse, l'aspartate et d'autres acides organiques (fumarate, succinate) sont inefficaces. Ces caracteristiques de photomarquage sont en parfait accord avec les proprietes de l'activite de transport du malate. L'implication du polypeptide de 37 kda dans la fonction de transport du malate a ete recherchee sur des bases fonctionnelles. Un serum polyclonal dirige contre le polypeptide de 37 kda a ete prepare. Il reconnait une proteine du tonoplaste de c. Roseus dans la region de 37 kda. De plus, les anticorps inhibent l'absorption du malate par des vesicules de tonoplaste et des vacuoles isolees: par contre, ils n'ont aucun effet sur l'absorption de leucine. L'analyse en conditions natives des proteines du tonoplaste apres photomarquage permet de visualiser une proteine de 160 kda, protegee par le malate 25 mm. Les proprietes de protection de cette proteine sont similaires a celles obtenues pour le polypeptide de 37 kda. Les anticorps obtenus precedemment revelent en conditions natives la meme bande de 160 kda. La denaturation de cette proteine montre que le polypeptide de 37 kda en est une sous-unite. Le transporteur de malate a donc une masse moleculaire native de 160 kda, et sur la base d'experiences de pontage entre les differentes sous-unites de ce complexe, une structure native de 4 polypeptides de 37 kda (homotetramere) est proposee