Etude de la structure moleculaire du site de liaison de l'acide gamma-aminobutyrique sur les recepteurs aux gaba de type a a par marquage d'affinite

Study of the molecular structure of gamma-aminobutyric acid binding site on gaba a receptors by site-directed affinity labeling

• Auteur / Autrice : Patrice Jacques
• Direction : Maurice Goeldner
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1996
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Résumé

Le recepteur gaba#a, glycoproteine hetero-oligomerique transmembranaire du systeme nerveux central, est un membre de la superfamille des recepteurs-canaux. La liaison du neurotransmetteur, l'acide gamma-aminobutyrique (gaba), provoque l'ouverture du canal ionique central permettant l'entree d'ions chlorures dans la cellule nerveuse qui vont inhiber l'influx nerveux. L'objectif de ce travail de these est l'etude de la structure moleculaire du site de liaison du neurotransmetteur sur le recepteur gaba a par marquage d'affinite a l'aide d'un analogue tritie rigide du gaba, le chlorure de meta-sulfonate benzene diazonium (msbd tritie). La radiosynthese necessaire a l'obtention de la sonde et sa purification par chromatographie liquide haute performance par echange d'ions ont ete mises au point. Les glycoproteines transmembranaires etant tres minoritaires par rapport aux autres proteines co-inserees dans la membrane, un marquage d'affinite specifique du recepteur gaba a n'a pas pu etre obtenu sur une preparation membranaire. C'est la purification repetee du recepteur par chromatographie d'affinite qui nous a permis d'obtenir un materiel homogene et enrichi, en quantite suffisante, pour entreprendre le marquage d'affinite. De nombreuses experiences d'optimisation de divers parametres ont ete necessaires a la mise au point d'un marquage d'affinite reproductible et efficace, avec un taux d'alkylation specifique du recepteur gaba a de 30%. Le marquage non specifique reste cependant eleve. L'elution passive de 90% du recepteur alkyle d'un gel de polyacrylamide suivie de sa proteolyse enzymatique par l'endoprotease lys-c et de la separation des fragments peptidiques obtenus en chromatographie liquide haute performance en phase inverse ont permis d'etablir une premiere cartographie du recepteur gaba#a. La selection d'un fragment marque de maniere specifique suivie du micro-sequencage devrait permettre l'identification du ou des residu(s) alkyle(s) par le msbd tritie