La nuclease de staphylococcus aureus, proteine modele pour l'etude de la secretion chez lactococcus lactis

Heterologous protein secretion in lactococcus lactis, using the staphylococcal nuclease as a model

• Auteur / Autrice : Yves Le Loir
• Direction : Alexandra Gruss
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1996
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

Peu de donnees sont disponibles concernant la secretion des proteines chez les bacteries lactiques (bl) et, en particulier, chez lactococcus lactis, la bl modele. Nous avons etudie la secretion de proteines heterologues chez l. Lactis a l'aide de la nuclease de staphylococcus aureus (snase). L'activite de cette enzyme est facilement detectable sur boite par un test colore. Nous avons exploite cette propriete pour developper de nouveaux vecteurs de clonage permettant un criblage direct des clones contenant un insert. Chez l. Lactis, 60% de la snase detectee sont dans le surnageant. Les 40% restants sont sous forme de precurseur intracellulaire. L'insertion d'un peptide de 9 residus (leisstcda) entre le peptide signal (ps) et la partie mature de la snase augmente l'efficacite de secretion (80% de proteine secretee). Le motif leisstcda ameliore aussi l'efficacite de secretion d'une forme de snase tronquee dans sa partie n-terminale. La fusion du ps d'usp45 (la proteine majoritairement secretee par les lactocoques) a la snase mature permet d'ameliorer encore la secretion avec environ 100% de snase detectee dans le surnageant. Les caracteristiques intrinseques de la proteine jouent donc un role determinant dans l'efficacite de secretion. Nous avons egalement utilise la snase pour identifier des facteurs d'hotes intervenant dans la secretion. Une mutagenese par transposition aleatoire a ete menee sur une souche de l. Lactis secretrice de snase. Le criblage a l'aide du test colore a permis de selectionner trois mutants: deux presentent une diminution de l'efficacite de secretion de la snase et d'usp45, le troisieme presente une forte accumulation intracellulaire de precurseur snase et la secretion d'usp45 n'est pas affectee. La caracterisation de ces trois mutants est en cours