Etablissement de banques d'adnc amplifies par pcr au debut du developpement de l'embryon de mammifere et application a l'etude des premiers evenements de differenciation au stade blastocyste chez les especes domestiques

Pcr-generated cdna libraries from mammalian embryos at the biginning of development and application to the study of the first differenciation events at the blastocyst stage in domestic species

• Auteur / Autrice : FREDERIQUE REVEL BARIGUIAN
• Direction : JEAN PAUL RENARD
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1996
• Etablissement(s) : Paris 6

Résumé

La mortalite embryonnaire in vivo et in vitro augmente fortement a l'implantation chez plusieurs mammiferes domestiques, au moment ou l'embryon est au stade blastocyste. Or le blastocyste est le stade ou se mettent en place les lineages cellulaires differencies. Notre objectif est de caracteriser les genes impliques dans la realisation de cet evenement, notament ceux qui president a l'apparition des premieres cellules differenciees. Nous decrivons une methode rapide et reproductible pour cloner des adnc amplifies, mise au point sur ovocytes de souris. La strategie consiste a amorcer la synthese d'adnc a partir d'extrait cellulaire brut grace a une amorce contenant un oligod(t) et de soumettre le premier brin d'adnc limite en taille a une extension homopolymerique en g. Tous les adnc sont alors amplifies par pcr grace a deux amorces complementaires des extremites oligod(a) et oligod(g) des adnc. Dans cette procedure, aucune etape de purification n'est necessaire. Nous avons obtenu 5. 10#6 clones a partir de 10 ovocytes. Le criblage de ce type de banque montre que l'abondance relative des transcrits est conservee pendant l'amplification et le clonage et que la procedure permet le clonage des sequences faiblement representees, au moins aussi rare que 0,008% des arnm. Cette methode de construction de banques d'adnc a ensuite servi a l'etude de la differenciation de l'endoderme primitif du blastocyste de lapin. Nous avons fait l'hypothese que le taux de synthese de un (ou plusieurs arn) responsable des premieres etapes de la differenciation du trophectoderme et de l'endoderme est augmente entre le moment de la mise en route du genome (8c/) et l'apparition du tissus endodermique (4,5 jr pc). Nous avons realise un criblage defferentiel d'une banque amplifiee par pcr de blastocyste (5,5 jr pc) de lapin avec des sondes egalement amplifiees par pcr d'embryons de lapin au stade blastocyste (5,5 jr pc) et 8-16c/. Deux genes exprimes preferentiellement dans les embryons au stade blastocyste sont issus du criblage. L'un est homologue du gene de la proteine ribosomale de rat rps21 et l'autre n'est pas connu des banques de donnees. Nous avons ensuite etudie les possibilites d'appliquer ce type de strategie pour caracteriser au niveau moleculaire la difference d'aptitude au developpement jusqu'au stade blastocyste observee entre des ovocytes fecondes de veaux ages de 3 mois et de vaches. L'aptitude au developpement des ovocytes de veaux a ete etudiee par maturation, fecondation et culture in vitro jusqu'au stade blastocyste et par transfert des embryons dans des meres receveuses. Les resultats ont montre que certains evenements clefs de regulation qui determinent l'aptitude a produire des blastocystes chez la vache, n'etaient sans doute pas acheves dans les ovocytes de veaux ages de 3 mois et pouvaient etre investigues au niveau moleculaire par notre methode de criblage differentiel de banques amplifiees par pcr.