Etude de l'udp-galnac : polypeptide n-acetylgalactosaminyltransferase et des sequences peptidiques impliquees dans la localisation de cette enzyme dans le golgi

Study of the udp-galnac: polypeptide n-acetylgalactosaminyltransferase and of the peptidic sequences involved in the localisation of this enzyme in the golgi

• Auteur / Autrice : CECILE VASSARD
• Direction : Véronique Piller
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1996
• Etablissement(s) : Orléans

Résumé

L'udp-galnac: polypeptide alpha-n-acetylgalactosaminyltransferase est l'enzyme qui intervient dans la premiere etape de la o-glycosylation des proteines de type mucines. Elle catalyse le transfert de galnac sur certaines serines et threonines des proteines. Recemment clonee, puis localisee dans le cis-golgi, cette proteine membranaire de type ii est consideree comme un marqueur de ce compartiment intracellulaire. Dans le but de determiner les sequences peptidiques responsables de la localisation intracellulaire de l'enzyme, nous avons immunise des animaux afin de produire des anticorps specifiques. Ces anticorps devraient permettre de localiser l'enzyme, transfectee dans des cellules cos-7, par immunofluorescence. Differentes techniques d'immunisation ont ete employees: immunisation avec une forme soluble de l'enzyme produite dans un systeme d'expression eucaryote performant (baculovirus / cellules d'insectes). Immunisation avec des peptides potentiellement antigeniques couples sur une proteine porteuse. Immunisation genetique a partir d'un vecteur d'expression contenant l'adnc de l'enzyme. Les anticorps obtenus par ces differentes methodes ont ete caracterises par elisa et par immunobuvardage, et reconnaissent specifiquement la galnactransferase. Cependant, en immunofluorescence, ces anticorps ne reconnaissent pas l'enzyme dans des cellules cos-7 transfectees. Pour determiner les sequences impliquees dans la localisation intracellulaire de l'enzyme, nous avons prepare differentes constructions de l'adnc de cette proteine ou sont deletees ou mutees les sequences potentiellement impliquees (region cytoplasmique, domaine transmembranaire, tige. . . ). Sur ces constructions, une sequence flag, codant pour un peptide contre lequel nous disposons de tres bons anticorps commerciaux, a ete ajoutee du cote 3' de la partie codante de l'adnc. Apres transfection de differents types cellulaires avec ces constructions, la localisation de l'enzyme a ete verifiee par microscopie confocale. Nos resultats permettent de conclure que: la region tige, ou du moins la sequence comprise entre les acides amines 34 a 94, semble importante pour la bonne localisation de la proteine. Le domaine transmembranaire, bien que ne semblant pas important a lui seul dans la retention de la galnactransferase, est implique dans la retention de la forme deletee de la region tige dans le reticulum endoplasmique. La galnactransferase est la premiere glycosyltransferase du cis-golgi dont la localisation est etudiee. Comme la plupart des glycosyltransferases, sa retention intracellulaire implique probablement de nombreux mecanismes (oligomerisation, interaction avec les proteines du cytosquelette. . . ) et plusieurs signaux peptidiques. Malgre toutes les constructions que nous avons testees, le signal de retention de cette proteine dans le cis-golgi n'est encore pas totalement defini, et la determination de ce signal necessite encore, entre autres choses, la realisation de proteines chimeres