Recherche Avancée

Thèse soutenue

Etude des relations structure-fonction dans le régulateur transcriptionnel FruR de la bactérie Escherichia coli

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Auteur / Autrice : Christelle Bonod-Bidaud
Direction : Alain-Jean Cozzone
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Sciences. Biochimie
Date : Soutenance en 1996
Etablissement(s) : Lyon 1
Jury : Président / Présidente : Alain-Jean Cozzone

Résumé

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La proteine frur, facteur pleiotrope appartenant a la famille des represseurs bacteriens laci-galr, controle soit positivement, soit negativement, la transcription de nombreux genes ou operons impliques dans le metabolisme des sucres chez e. Coli. Des experiences d'hydrolyse menagee par la trypsine ont montre que frur est organisee en deux domaines structuraux distincts: un domaine n-terminal de 57 residus, appele frur1, responsable de la fixation sur le dna, et un domaine c-terminal de 277 acides amines, implique dans l'oligomerisation de la proteine et dans la fixation de l'inducteur, le fructose-1-phosphate. Le peptide frur1 a ete surproduit et purifie a homogeneite afin de determiner sa structure tridimensionnelle par modelisation moleculaire sous contrainte rmn. L'etude de la fixation d'oligonucleotides degeneres sur la proteine frur par la technique de selection du site de fixation a permis de determiner la sequence consensus suivante de l'operateur fru: 5'-g c t g a a #. C / g #. T - 3'. L'organisation pseudo-palindromique de cette sequence suggere que le regulateur interagit de facon asymetrique avec chacun des deux demi-sites de son operateur. Le mecanisme moleculaire de l'interaction de frur et de la rna polymerase au niveau des zones regulatrices des genes pfka et ppsa a ete analyse par diverses experiences de modifications enzymatiques et chimiques du dna telles que les empreintes a la dnase i, la methylation des guanines par le dimethylsulfate, la depurinisation et/ou la depyrimidinisation. Ces approches ont permis de detecter un site promoteur de fixation de la rna polymerase et un site operateur fru en amont de ces deux genes dont la transcription est inhibee (gene pfka) ou activee (gene ppsa) par frur. De plus, des experiences de transcription in vitro ont montre que frur est capable d'activer la transcription du gene ppsa, independamment de tout autre facteur proteique. Enfin, des etudes de fluorescence intrinseque realisees sur la proteine frur, en presence de fructose-1-phosphate, ont revele que l'interaction de l'inducteur est un phenomene biphasique qui comprend une premiere phase correspondant a la fixation du phosphosucre et une deuxieme phase traduisant un changement conformationnel du complexe proteine-inducteur