Voies de formation et rôle de l'acide phosphatidique lors de l'activation mitogénique des thymocytes de rat

= Role and synthesis pathways of phosphatidic acid during mitogenic stimulation of rat thymocytes

• Auteur / Autrice : Samer El Bawab
• Direction : Annie-France Prigent
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance en 1996
• Etablissement(s) : Lyon, INSA
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé (Villeurbanne ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : LCB - Chimie Biologique (Lyon, INSA1960-1996)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Rats

Lymphocytes -- Activation

Acides phosphatidiques

Résumé

L’étude que nous avons réalisée a porté sur les étapes de signalisation mises en jeu dans la phase précoce de l’activation lymphocytaire. Les données de notre groupe avaient suggéré que l'acide phosphatidique (PA) formé très rapidement dans les cellules lymphoïdes en réponse aux mitogènes, pourrait activer la phosphodiestérase des nucléotides cycliques (PDE)-AMPc spécifique (PDE4). Pour étayer cette hypothèse et mieux préciser ce rôle proposé du PA dans les thymocytes de rat nous avons cherché, dans un premier temps à quantifier et à analyser par chromatographie en phase gazeuse les acides gras du PA formé pendant la stimulation mitogénique. Nous avons pu mettre en évidence une augmentation rapide de la masse du PA (5 mn) ainsi qu’une augmentation de son contenu en acide arachidonique dans les cellules stimulées par la concanavaline A. Dans un deuxième temps, nous avons essayé de déterminer par quelles voies et à partir de quels phospholipides le PA était formé. Pour cela nous avons fait des expériences de marquage radioactif classique et avons également analysé les espèces moléculaires de PA et de certains lipides potentiellement précurseurs de PA par HPLC en phase inverse, en utilisant une technique de détection fluorimétrique très sensible. Ces études ont montré que le PA formé en réponse à l'activation mitogénique des thymocytes dérive, via la phospholipase C de deux compartiments phospholipidiques, les phosphoinositides (65%) et les phosphatidylcholines (35%). Dans un dernier temps, nous avons essayé de caractériser en système acellulaire l'activation de la PDE par le PA en utilisant des isoformes recombinantes de PDE4 et des PAs synthétiques contenant différents acides gras à degré d'insaturation variable en position sn2. Nous avons observé que l'espèce moléculaire 18:0/20:4 PA, formée pendant la stimulation mitogénique, est la plus efficace pour activer des isoformes recombinantes de PDE4, la PDE-4A5 et la PDE-4D3.

The present study deals with the signaling events involved in early stages of lymphocyte activation. Previous results from our group have suggested that the cAMP-specific cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE4) might be a physiological target of phosphatidic acid (PA) formed upon mitogenic stimulation of lymphoid cells. To support this hypothesis and more precisely define the role of PA in rat thymocytes, we have first quantified and analyzed the PA fatty acid composition by gaz liquid chromatography. We observed a rapid increase in the PA mass as well as an increase in its arachidonic acid content upon concanavalin A stimulation. In a second time, we have investigated the pathways of PA synthesis and identified the phospholipid precursors of newly formed PA In this view, classical labelling experiments were performed and molecular species of PA and of the potential phospholipid precursors were analyzed by reverse phase using fluorometric detection. Results from this study have shown that PA is formed via specific phospholipase C pathways hydrolyzing both phosphoinositides (65%) and phosphatidylcholines (35%). Finally, using recombinant PDE4 isoforms and synthetic PA species, we have evaluated the activating effect of the major PA molecular species identified in thymocytes. We observed that 18:0/20:4 PA species, formed during mitogenic stimulation, was the best activator of the recombinant PDE4 isoforms: PDE4A5 and PDE4D3.