Mise en oeuvre de cellules recombinées de Bacillus Subtilis en cultures continues : effet de l'immobilisation sur la stabilité plasmidique

Study of Bacillus Subtilis recombinant cells in continuous cultures : effect of immobilization on the plasmid stability

• Auteur / Autrice : Muriel Craynest
• Direction : Jean-Noël Barbotin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génie Enzymatique, Bioconversion et Microbiologie
• Date : Soutenance en 1996
• Etablissement(s) : Compiègne
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences pour l'ingénieur (Compiègne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Carraghénanes

Plasmides

Bacillus subtilis

Mots clés libres

Immobilisation

Culture continue

Cellules recombinées

Résumé

Ce travail porte sur l'étude de la stabilité plasmidique de cellules recombinées de Bacillus Subtilis en conditions de cultures continues libres et immobilisées sans pression de sélection. Deux plasmides sont étudiés : le plasmide pHV1431 à multiple copies ayant un mode de réplication theta et un plasmide intégré et amplifié dans le chromosome bactérien (souche AP551). Le plasmide pHV1431 chez B. Subtilis MT119 est très instable en cultures continues aux deux températures étudiées (30°c et 37°c). Cette instabilité est plus prononcée à 30°c, et est de type ségrégationel puisqu'aucune instabilité structurale n'a été mise en évidence. De plus, à 30°c, des stabilisations de l'instabilité plasmidique ont été observées provenant d'éventuelles mutations spontanées. Les cultures réalisées à partir de cette souche variante ont montré que cette amélioration de la stabilité doit être en relation avec une diminution du nombre de copies. B. Subtilis (pHV1431) a donc été immobilisée dans des billes de carraghenane afin d'améliorer la stabilité plasmidique. Aux deux températures de culture, la stabilité a été augmentée par rapport aux cultures libres. Cependant, l'instabilité reste néanmoins présente. Des observations microscopiques et l'étude de la densité de l'inoculum au sein des billes confortent l'hypothèse de l'amélioration de la stabilité par la compartimentation des cellules et le relargage cellulaire. De plus, une augmentation sensible du nombre de copies a été observée en cultures immobilisées. Cette augmentation pourrait être due à la différence de croissance de cellules au sein de la bille. La souche AP551 possède un plasmide amplifiable intégré dans le chromosome. Cette souche a été étudiée en cultures continues, et montre, assez rapidement, une perte de l'amplification plasmidique. Lors des cultures immobilisées, l'amplification plasmidique a été maintenue plus longtemps que lors des cultures libres. Mais, cette amplification reste également instable lors de l'immobilisation. Une culture en double réacteur (cellules immobilisées dans le premier réacteur et cellules libres dans le deuxième) a été réalisée. La culture en double réacteur permet de séparer la phase de croissance des microorganismes (avec induction de l'amplification plasmidique) et celle de production de l'enzyme exprimée par le plasmide. Ces derniers résultats ont montré qu'il serait préférable d'amplifier le plasmide lors de la phase de production de l'enzyme.