Purification et caractérisations chimique et fonctionnelle de la purine-cytosine perméase de la membrane plasmique de la levure Saccharomyces cerevisae

• Auteur / Autrice : Benoît Pinson
• Direction : Jean Chevallier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et médicales. Biologie-Santé
• Date : Soutenance en 1996
• Etablissement(s) : Bordeaux 2

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cytochimie

Saccharomyces cerevisiae

Phosphorylation

Relations structure-activité

Purification

Purines

Mots clés libres

Saccharomyces cerevisiae

Purine-cytosine permease

Membrane plasmique

Purification

Phosphorylation

Bioenergetique

Résumé

L'objectif de ce travail est l'étude biochimique et bioénergétique du mécanisme moléculaire de fonctionnement de la Purine-Cytosine Perméase (PCP), protéine intrinsèque de la membrane plasmique de la levure Saccharomyces cerevisiae qui catalyse l'entrée dans la cellule de trois bases purines (adenine, hypoxanthine et guanine) et de la cytosine. La PCP solubilisée par un détergent non ionique a pu être purifiée par chromatographie d'affinité, soit par une colonne de chélate de nickel en travaillant avec une forme modifiée de la protéine (six résidus histidyles ajoutés à son extrémité C-terminale), soit sur une colonne d'immunoaffinité construite avec un anticorps anti-C terminal, mais en travaillant cette fois-ci avec la forme sauvage du transporteur. Ces deux approches ont permis d'obtenir des échantillons de PCP pure à 90 %, et l'analyse de la séquence de la protéine purifiée nous a montré que cette protéine avait son extrémité N-terminal bloquée. L'immunoprécipitation de la PCP après des marquages in vivo des proréines cellulaires avec de l'ortophosphate radioactif a permis de mettre en évidence que la PCP est phosphorylée. Cette phosphorylation se produit sur des résidus séryles au cours du trafic des protéines entre l'appareil de Golgi et la membrane plasmique ou dans cette membrane elle même. La fusion (par congélation décongélation et extrusion) de préparations enrichies en membranes plasmiques de souches surexprimant la PCP et de protéoliposomes contenant la cytochrome c oxydase a permis d'obtenir des vésicules closes dans lesquelles nous avons pu générer une différence de potentiel électrochimique transmembranaire en protons. Ce système artificiel a permis de prouver que la PCP est un transporteur actif secondaire qui catalyse un symport proton/base et qui utilise principalement la composante chimique de la force proton-motrice.

The aim of this work is the biochemical and bioenergetical analyses of the uptake mechanism of the Purine-Cytosine Permease (PCP), a protein located in the plasma membrane of the yeast Saccharomyces cerevisiae which catalyses adenine, guanine, hypoxantine and cytosine transport in cells. After solubilisation with a non ionic detergent, PCP was purified by affinity chromatography, either on nickel chelate affinity column using a recombinant PCP carrying a carboxy-terminal affinity tag for metallic ions (six successive histidyl residues), or on immunoaffinity column obtained with anti-C-terminal peptide) IgG using a wild-type PCP. By means of these two chromatographies, we have obtained a PCP enriched fraction containing 90 % of this protein. Determination of the PCP saquence shows a blocked N-terminal extremity. By means of in vivo radioactive ortophosphate labelling of cells proteins and PCP immunoprecipitation, we demonstrate that this protein is phosphorylated. This phosphorylation occurs on seryls residues in the secretory pathway either between the Golgi apparatus and the plasma membrane or in the plasma membrane itself. Plasma membrane enriched fractions containing PCP were fused with proteoliposomes containing cytochrome oxidase to obtain closed vesicles in which proton motive force could be generated and maintained. By means of this artificial system, we demonstrate that PCP is a secondary active carrier that catalyses a proton/base symport using mainly the chemical component of the proton motive force.