Esterase thermophile de Bacillus licheniformis : clonage du gène, caractérisation biochimique et application biotechnologique

Bacillus Licheniformis thermophilic esterase: gene cloning, biochemical characterization and biotechnological application

• Auteur / Autrice : Elisa Alvarez-Macarie
• Direction : Jacques C. Baratti
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et microbiologie
• Date : Soutenance en 1996
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 2
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université d'Aix-Marseille II. Faculté des sciences (1969-2011)

Résumé

Les objectifs principaux de ce travail ont ete l'etude du gene qui confere a la souche lcb40 de bacillus licheniformis la faculte de pousser sur un milieu mineral avec, comme seule source de carbone, du tween 80, ainsi que la caracterisation des activites d'hydrolyse et de synthese d'esters de l'extrait brute d'une souche d'e. Coli recombinante contenant ce gene. Dans un premier temps, nous avons construit une banque genomique de b. Licheniformis dans e. Coli et isole et caracterise un gene codant pour une enzyme capable d'hydrolyser la tributyrine. D'apres la sequence en acides amines deduite de celle en acides nucleiques, la premiere glycine du pentapeptide conserve parmi les hydrolases a serine (gly-x-ser-x-gly) est remplacee par une alanine comme dans le cas des lipases de b. Subtilis, b. Pumilus et g. Candidum. Lors des essais de purification du produit du gene, nous avons observe que la proteine est degradee proteolytiquement, ce qui resulte en plusieurs proteines actives de differentes tailles, dont la plus petite de 25 kda. Nous avons donc caracterise dans un deuxieme temps l'hydrolyse d'esters avec l'extrait brut d'une souche d'e. Coli recombinante contenant le gene. L'etude de la specificite de substrat nous a permis de classer l'enzyme comme etant une esterase, car elle n'hydrolyse pas l'huile d'olive. Neanmoins, il s'agit d'une esterase un peu particuliere car elle presente une preference envers les acides gras de p-nitrophenol a chaine intermediaire et non pas a courte chaine comme la plupart des esterases. De plus, elle est plus proche des lipases en ce qui concerne son comportement en presence de pmsf, puisqu'elle est legerement inhibee par ce reactif. Les esterases sont presque completement inhibees par le pmsf en raison de sa fixation a la serine catalytique, laquelle n'est pas protegee par un couvercle comme dans le cas des lipases. Finalement, nous avons demontre la faisabilite de synthetiser des esters a chaine intermediaire avec l'extrait brut de la souche recombinante