Recherche de nouveaux marqueurs biochimiques de pollution : l'induction des cytochromes P450 par les xénobiotiques chez les végétaux supérieurs

Biomonitoring of chemical pollution : induction of plant cytochromes P450 by xenobiotics

• Auteur / Autrice : Yannick Batard
• Direction : Danièle Werck-Reichhart
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Toxicologie et biologie de l'environnement
• Date : Soutenance en 1995
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des Sciences de la Terre et Environnement (Strasbourg ; 2000-....)

Résumé

Les cytochromes P450 sont des oxygénases présentes chez tous les organismes vivants, qui catalysent la métabolisation de molécules endogènes (stérols, acides gras, hormones…) et exogènes (drogues, polluants…). Ils ont la particularité d’être fortement inductibles par les xénobiotiques. Cette propriété est exploitée, chez les animaux, pour la détection précoce de pollution chimique. L’objectif de ce travail était de développer des marqueurs végétaux permettant le même type de détection. L’induction des P450 végétaux a été étudiée dans un système modèle : le tubercule de topinambour blessé et mis en survie en présence de divers xénobiotiques. La 0-déalkylation de huit substrats artificiels (alkoxycoumarines et alkoxyrésorufines) et l’hydroxylation d’un substrat naturel, l’acide trans-cinnamique, ont été mesurées dans les microsomesdes tissus traités. Quatre nouvelles activités ont pu être mises en évidence. Toutes les activités testées sont sensibles à la blessure et aux traitements. Plusieurs isoformes de P450 semblent participer à la déalkylationde chaque famille de substrats. Une enzyme, présentant une activité 7-éthoxycoumarine 0-dééthylase (ECOD) a été partiellement purifiée, permettant l’obtention d’anticorps et de séquences peptidiques. Ceux-ci ont permis de cribler une banque d’ADNc de topinambour induit par l’aminopyrine et d’isoler les séquences codantes de deux nouveaux P450 : CYP76BI et CYP81BI. L’étude de la régulation de ces deux P450 ainsi que du CYP73A1 (cinnamate 4-hydroxylase), en réponse à la blessure ou au traitement par les xénobiotiques semble s’effectuer essentiellement à un niveau transcriptionnel. Trois outils sont donc utilisables pour détecter l’induction des P450 végétaux en réponse à une pollution chimique : leurs activités enzymatiques, les anticorps permettant leur immunoquantification et les séquences nucléotidiques permettant de doser les transcrits correspondants. Leur application à un matériel végétal prélevé sur le terrain a été discutée.

Cytochromes P450 are ubiquitous oxygenases involved in the metabolization of endogenous (sterols, fatty acids, hormones…) and exogenous (drugs, pollutants…) molecules. They are highly inducible by xenobiotics. The induction of animal P450s has therefore been used to monitor chemical pollution. The main purpose of this work was to achieve such a monitoring using the plant enzymes. Induction of plant P450s was studied in a model system: Jerusalem artichoke tuber slices aged in water containing various xenobiotics. 0-dealkylation of eight synthetic fluorescent molecules (alkoxycoumarins and alkoxyresorufins) and hydroxylation of one natural substrate (trans-cinnamic acid) were measured in microsomes from treated tissues. Four new substrates of planf P450s have thus been evidenced. All of the tested activities were increased by wounding and by chemical treatments. Dealkylation of the two series of fluorescent substrates apparently involved several ensymes. A 7-ethoxycoumarine 0-deethylase (ECOD) was partially purified and sequenced. Antobodies and deduced oligonucleotides were used to screen a cDNA library from aminopyrine-induced tissues. They allowed isolation of the cDNAs of two P450s belonging to new subfamilies, CYP76B1 and CYP81B1. The synthesis of these two P450s and of CYP73A1 (the cinnamate 4-hydroxylase) after wounding and chemical treatments seems to be primarily regulated at the transcriptional level. Three techniques are thus available to detect plant P450 induction resulting from exposure to xenobiotics: measurement of enzymatic activities, immunoquantification, and molecular hydridization. Their use for the monitoring of chemical pollution has been discussed.