Ligation non-enzymatique de l'adn et etude de la reconnaissance de degradation de l'adn par les bleomycines

Non-enzymatic ligation of dna and degradative recognition of dna by bleomycins

• Auteur / Autrice : Guy Zuber
• Direction : Jean-Paul Behr
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées
• Date : Soutenance en 1995
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Résumé

La ligation d'adn est le point faible des methodes de clonages de genes. Nous avons developpe une alternative nonenzymatique simple a cette reaction qui emploie des reactifs commerciaux. La methode utilise l'affinite de la distamycine pour le petit silon de l'adn pour stabiliser les extremites cohesives de l'adn. Les liaisons phosphoesters sont formees par activation du phosphate avec du n-cyanoimidazole et en presence de cations manganese (ii). Apres transfection dans des cellules eucaryotes, les produits de ligation chimique sont transcrits avec une efficacite similaire, sinon superieure a la ligation enzymatique. Nous montrons aussi qu'un conjugue spermine-imidazole agit comme un substitut a la ligase en augmentant le rendement et la vitesse de la ligation d'adn induite par le n-cyanoimidazole. Les blemycines (blms) sont des antibiotiques anticancereux qui degrade l'adn avec une selectivite pour les sequences 5'-gc-3'. Bien que le bithiazole est un domaine de la blm indispensable a son interaction avec l'adn, sa contribution a la reconnaissance de sequence et sa localisation dans l'adn sont indeterminees. Les chlorobithiazoles sont capables de degrader l'adn avec de la lumiere. Nous montrons que les chlorobithiazoles oxydent regioselectivement les desoxyriboses de l'adn en fonction de leurs modes de liaisons. La preparation de bleomycines a#2 ayants des bithiazoles chlores a ete effectuee. Ces nouvelles bleomycines activees avec du fer (ii) sont capables de degrader l'adn d'une maniere identique a la blm naturelle. L'empreinte de coupure generee par photoirradiation des bleomycines chlorees montre que le bithiazole est localise en 3' du nucleotide cible par la bleomycine