Developpement de methodes de cristallisation bi-dimensionnelle sur surfaces lipidiques. Contribution a l'etude structurale du recepteur nicotinique de l'acetylcholine

• Auteur / Autrice : PHILIPPE RINGLER
• Direction : Alain Brisson
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Psychologie
• Date : Soutenance en 1995
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Résumé

L'objet de ce travail de these concerne la cristallisation bi-dimensionnelle (2-d) de proteines solubles et membranaires en vue de leur etude structurale par cristallographie electronique. Dans une premiere partie sont developpees plusieurs methodes de cristallisation de proteines solubles basees sur l'interaction des proteines avec des surfaces lipidiques. Dans le but de rationaliser la cristallisation 2-d sur films lipidiques, des etudes d'interactions proteine/lipide menees sur des systemes modeles de liposomes ont ete menees. Ces etudes ont conduit au developpement d'une nouvelle technique d'analyse des interactions proteines/lipides au moyen de l'electrophorese en gel de polyacrylamide. Une nouvelle methode de cristallisation helicoidale de la streptavidine par liaison specifique a des vesicules lipidiques tubulaires a ete decouverte. Ces cristaux tubulaires presentent une affinite pour des molecules biotinylees et constituent un nouvel outil pour la cristallographie electronique. Des essais de cristallisation 2-d de proteines solubles par liaison covalente a des surfaces lipidiques ont egalement ete realises. Dans une deuxieme partie diverses approches de cristallogenese 2-d du recepteur nicotinique de l'acetylcholine (nachr) ont ete explorees. Une nouvelle methode de chromatographie d'affinite utilisant l'alpha toxine du venin de naja nigricollis greffee regioselectivement de maniere reversible permettant la purification du complexe alpha toxine/nachr a ete mise au point. La purification de vesicules riches en nachr a ete elaboree utilisant le complexe covalent entre l'alpha toxine de naja nigricollis et le fragment a2b5 de la toxine du cholera. Le complexe ainsi forme permet l'agregation specifique des vesicules riches en nachr. Des essais de cristallisation 2-d par reconstitution d'une phase lipidique lamellaire a partir des solutions de recepteur purifie et de lipides additionnels ont ete realises. Enfin, la cristallogenese 2-d du nachr par l'adaptation aux proteines membranaires de la methode de cristallisation sur film lipidique a ete developpee