Expression de proteases : expression et mutagenese dans escherichia coli de la leucine aminopeptidase de la bacterie d'algue marine aeromonas proteolytica. expression et caracterisation de la protease du virus de l'herpes

Expression of proteases: expression and mutagenesis in escherichia coli of the leucine aminopeptidase of the marine algae bacteria aeromonas proteolytica. Expression and characterisation of the herpesvirus protease

• Auteur / Autrice : SYLVIE GODEFROY DEGRANGE
• Direction : Y. BOULANGER
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1995
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Résumé

Le premier chapitre est consacre a l'etude d'une exopeptidase, la leucine aminopeptidase (lap) de la bacterie d'algue marine a. Proteolytica, enzyme constituant un modele simple d'etude des metalloenzymes a deux zincs. L'approche envisagee afin de determiner les residus impliques dans le site actif de l'enzyme et jouant un role dans la fixation du zinc est une approche de mutagenese. La lap d'a. Proteolytica presente des caracteristiques communes avec la lap de cristallin de buf (dont la structure a ete resolue recemment): fixation de deux atomes de zinc par sous-unite, absence du motif caracteristique de fixation du zinc hexxh, forte proportion de residus acides et non implication du domaine amino-terminal dans la catalyse. La lap de cristallin de buf, constitue le premier exemple d'aminopeptidase realisant la coordination du zinc par des residus acides. Il n'existe aucune homologie de sequence entre ces deux aminopeptidases et la strategie adoptee est basee sur l'hypothese qu'elles auraient le meme mode de fixation du zinc, par des residus acides situes dans le domaine c-terminal. Les formes natives de la lap, ainsi que des mutants (deletes ou ponctuels au niveau de certains residus acides) ont ete exprimes dans e. Coli, dans le systeme de fusion a la maltose binding protein (mbp) appele pmal-cr1. Il permet l'expression de la proteine fusionnee recombinante et sa purification en une seule etape par chromatographie d'affinite. Les deux domaines sont separes par clivage avec le facteur xa. Le systeme a ete optimise par insertion d'un bras espaceur et d'un site de clivage supplementaire. L'interpretation des resultats concernant les proteines recombinantes, par rapport a la structure de l'enzyme sauvage indique que l'activite enzymatique est probablement alteree du fait de l'absence d'un pont disulfure important dans le site de fixation du substrat. La seconde partie concerne l'etude d'une endopeptidase, la protease du virus de l'herpes hsv-1, recemment identifiee comme etant essentielle au processus de maturation du virus: elle est responsable de la maturation du precurseur de la proteine d'assemblage code par ul26. 5. Cette enzyme est codee par le gene ul26 et l'activite proteolytique est contenue dans les 247 residus n-terminaux. Nous avons exprime le produit de ul26 et de la region codant pour les 247 aminoacides n-terminaux decrits comme la plus petite sequence active, dans differents systemes eucaryotes et procaryotes. Grace a des experiences de transcription/traduction couplees in vitro, nous avons mis en evidence l'autocatalyse du produit de ul26 aux deux sites putatifs lqas et vnas aboutissant a la production de la protease mature. Nous avons egalement montre que la deletion des residus 245-248 abolit le clivage au site n-terminal mais pas au site c-terminal. L'expression d'une forme contenant les 329 premiers residus ne permet pas la maturation au site n-terminal. L'autoproteolyse se ferait donc dans un ordre defini: le clivage n-terminal necessiterait une maturation prealable au site c-terminal. L'expression bacterienne sous forme fusionnee a la mbp a permis la production d'un anticorps polyclonal. Les formes fusionnees a la mbp sont toxiques pour e. Coli. L'autocatalyse a egalement ete mise en evidence dans le systeme d'expression baculovirus/cellules d'insecte. L'activite en trans de la protease exprimee dans les baculovirus a ete mise en evidence en utilisant un substrat recombinant, comportant des repetitions en tandem du site de clivage, exprime dans e. Coli (zz(as)4bb). Les sites de clivage ont ete definis precisement: la protease clive a 3 des 4 sites inseres