Surexpression du recepteur de la lutropine. Reassociation fonctionnelle de ses deux domaines

Overexpression of the lutropin receptor. Functional reassociation of its two domains

• Auteur / Autrice : VERONIQUE BOZON
• Direction : Roland Salesse
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1995
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

L'etude structurale du recepteur lh necessite une quantite abondante de cette proteine sous forme recombinante. Avec le systeme de production baculovirus-cellules d'insecte, l'ectodomaine a ete surexprime (2 10#9 recepteurs/cellules), cependant il restait bloque a l'interieur des cellules sous forme agregee. La modification de certains parametres comme, le promoteur (le promoteur de la polyedrine etant remplace celui de la proteine p10) ou le peptide signal (la sequence porcine a ete remplacee par celle de la melittine, une proteine secretee d'insecte) ont permis la secretion de l'ectodomaine a un taux de 1 a 3 10#5 recepteurs/cellule. Ainsi, il semblerait que les cellules d'insecte ne permettent pas la maturation post-traductionnelle correcte de proteines recombinantes abondamment exprimees. Seule une production plus faible permet la secretion de l'ectodomaine. Les ectodomaines secretes sont stabilises et deviennent insensibles a la degradation en se complexant avec leur ligand, hcg, place dans le milieu de culture pendant l'infection des cellules. De plus, le complexe a ete immunopurifie. Par ailleurs, la co-expression de l'ectodomaine et des sous-unites hormonales pourrait permettre directement la secretion de complexes. Le recepteur entier recombinant (plhrm) a ete exprime a la surface des cellules (2 10#5 recepteurs/cellule) sous forme fonctionnelle. Cependant, il est sensible a la proteolyse. De plus, la co-expression de l'ectodomaine avec l'endodomaine du recepteur de lh a permis la reconstitution d'un recepteur membranaire (plhrd) a un taux de 8 10#5 recepteurs/cellules et de facon surprenante sous forme plus resistante a la degradation que plhrm, peut etre grace a la formation potentielle de ponts disulfures inter domaines. L'endodomaine semblerait donc aider l'ectodomaine surexprime a se replier correctement, comme une proteine chaperon. De plus, il contient d'autres signaux permettant l'insertion membranaire du recepteur reconstitue. L'expression abondante de plhrd vont permettre son immunopurification