Etude par fluorescence résolue en temps de la dynamique conformationnelle des proteines

Time resolved fluorescence study of the conformational dynamics of proteins

• Auteur / Autrice : Fabienne Mérola
• Direction : Jean-Claude Brochon
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1995
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

La fluorescence résolue en temps apporte différentes informations sur la structure et la dynamique interne des protéines en solution. Après quelques rappels fondamentaux, nous présentons l'état actuel des connaissances sur la spectroscopie du tryptophane, le principal chromophore des protéines. Une étude limitée du coenzyme NADH, réalisée comme première utilisation mondiale d'un laser à électrons libres sur anneau de stockage, permet ensuite une introduction méthodologique. La thioredoxine d'escherichia coli est une petite protéine de transport redox possédant un pont disulfure expose et très réactif. L'étude de la fluorescence de ses deux résidus tryptophane a constitué l'une des premières applications de la méthode d'analyse par maximisation d'entropie. Cette fluorescence, comme celle de nombreuses protéines étudiées ultérieurement, apparait constituée d'un petit nombre de composantes discrètes en échange lent par rapport à la nanoseconde, qui résulteraient principalement des équilibres acide-base et des équilibres conformation els internes de la protéine. La haute résolution des données a permis de suivre ces espèces avec précision, en fonction de la température et de l'état redox de la protéine. Nous avons ensuite étudié la fluorescence du résidu tryptophane unique situe dans la boucle active respective de toxines de venin de serpent, telles que la cardiotoxine de naja nigricollis et l'erabutoxine de laticauda semifasciata. Un formalisme d'analyse spécifique est proposé pour quantifier l'autoassociation de la cardiotoxine en solution. Dans le cas de la cardiotoxine monomérique, des hétérogénéités de fluorescence tres importantes sont observées à température ambiante, qui semblent associées à des échanges intermédiaires nanoseconde, et sont accompagnées de flexibilités limitées, mais significatives, de la chaine laterale du tryptophane. La boucle active de l'erabutoxine présente au contraire une très grande rigidité locale, a toutes les échelles de temps supérieures a la picoseconde. Ces différentes propriétés dynamiques pourraient avoir des implications dans les mécanismes d'action respectifs des cardiotoxines et des neurotoxines