Systèmes multi-enzymatiques compartimentés pour l'étude des phénomènes de réaction-diffusion aux interfaces à l'aide d'un biocapteur à fibres optiques

Compartimentalized enzyme layers for studying reaction. Diffusion phenomenon at membrane/solution interfaces using a fiber optic biosensor

• Auteur / Autrice : Agnès Berger-Collaudin
• Direction : Loïc Blum
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences. Génie biologique et médical
• Date : Soutenance en 1995
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Jury : Président / Présidente : Loïc Blum

Mots clés

Mots clés contrôlés

Complexes multienzymatiques

Peroxydase

Fibres optiques

Chimiluminescence

Enzymes immobilisées

Biocapteurs

Résumé

Le travail presente concerne l'etude, en milieu heterogene, d'un systeme luminescent, pour la conception d'un biocapteur mono- ou bienzymatique. La peroxydase de raifort, catalyseur de la reaction de chimiluminescence du luminol, est immobilisee sur une membrane de polyamide preactivee. Ce biorecepteur est place au contact d'un transducteur constitue d'un faisceau de fibres optiques connecte au tube photomultiplicateur d'un luminometre. Une detection sensible d'h#2o#2 a ete realisee avec le biocapteur a fibres optiques implante dans un systeme a injection dans le flux. La determination de conditions reactionnelles optimales a permis d'obtenir une gamme dynamique de mesure presentant une zone de linearite pour une quantite d'h#2o#2 injectee variant de 6,25 pmol a 2,5 mol. La sensibilite du biocapteur a ete amelioree par la presence d'un amplificateur chimique de la reaction de chimiluminescence du luminol (p-iodophenol ou luciferine) ou par la presence d'une forte concentration saline. Les meilleurs resultats, en terme de sensibilite, ont ete obtenus en presence de nacl3 m. La limite de detection est alors egale a 3,75 pmol d'h#2o#2 et dans la gamme d'h#2o#2 6,25 pmol - 25 nmol, la valeur du facteur d'amplification augmente de 3 a 8. Un biocapteur specifique du l-lactate a ensuite ete developpe en couplant la reaction d'oxydation du lactate par la lactate oxydase a la reaction de chimiluminescence du luminol. Son principe, original, est base sur l'immobilisation des enzymes sur deux membranes distinctes. Ces membranes sont empilees l'une sur l'autre et placees au contact du transducteur. Ce systeme compartimente a permis d'obtenir une amplification de la reponse du biocapteur d'un facteur 22 par rapport a celle obtenue avec les deux enzymes coimmobilises sur une meme membrane. La compatibilite de fonctionnement en sequence des deux enzymes a ete etudiee a l'aide du biocapteur equipe du systeme compartimente. Avec les conditions optimales que nous avons determinees, le biocapteur permet la determination en flux continu de quantites de l-lactate variant de 250 pmol a 1,25 mol. La limite de detection est egale a 250 pmol de l-lactate. L'etude de la stabilite au stockage et operationnelle de chacun des enzymes a permis d'obtenir un biocapteur fiable pour la detection du l-lactate dans des echantillons biologiques