Recherche Avancée

Thèse soutenue

Substitutions d'acides aminés conservés de la thiorédoxine de R. Sphaeroides : conséquences sur ses propriétés catalytiques et sur ses fonctions biologiques chez R. sphaeroides

FR  |  
EN
Auteur / Autrice : Karine Assemat
Direction : Jenny D. Clément-Métral
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Génie enzymatique, bioconversion et microbiologie
Date : Soutenance en 1995
Etablissement(s) : Compiègne
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences pour l'ingénieur (Compiègne)

Résumé

FR

La thiorédoxine, petite protéine ubiquitaire, possède un site actif dithiol / disulfure lui permettant de catalyser de nombreuse réactions d'oxydoréduction de protéines. En outre, sa forme réduite est une sous-unité essentielle de l'ADN polymérase du phage T7. La structure tridimensionnelle de cette protéine thermostable est constituée d'un feuillet entouré d'hélices, qui délimitent deux groupes très compacts de résidus hydrophobes. La thiorédoxine de R. Sphaeroides est capable de remplacer la thiorédoxine d'E. Coli pour ses fonctions de donneur d'hydrogène (croissance sur MetSO) et de multiplication du bactériophage T3/7. Cette propriété a été utilisée afin d'étudier les conséquences fonctionnelles des substitutions du résidu F25, acide aminé conservé du cœur hydrophobe. Cinq protéines mutantes (F25A, F25V, F25L, F25I et F25Y), construites par mutagenèse site dirigée, ont été caactérisées in vitro et in vivo chez un mutant TrxA- d'E. Coli. Les différentes souches, excepté elle exprimant la thiorédoxine F25A, sont capables de pousser sur MetSO aussi bien à 37°C qu'à 42°C. Par contre, seule la souche exprimant la protéine F25I supporte la multiplication du bactériophage T3/7. Ce résultat indique que de très petites modifications (Ileu/Leu ou Pheyr) introduites à l'intérieur de la protéine, en position 25, peuvent provoquer des effets fonctionnels très différents. De plus, la détermination des énergies libres de dénaturation montre que ces changements de propriétés fonctionnelles ne sont pas corrélés avec les différences de stabilité mesurées entre les différentes protéines mutantes. La deuxième partie de ce travail s'est inscrite dans le programme d'étude des fonctions de la thiorédoxine chez R. Sphaeroides. Les données de l'analyse génétique ont suggéré que la thiorédoxine, essentielle à la croissance aérobie et anaérobie de ce microorganisme photosynthétique facultatif, serait impliquée dans la protection des cellules contre le stress oxydatif, rôle compatible avec sa fonction d'oxydoréductase générale. Ainsi, nous avons tenté de construire un mutant de R. Sphaeroides exprimant une thiorédoxine dépourvue d'activité catalytique. La protéine mutante C33S est incapable de restaurer la viabilité du mutant TrxA-suggérant que l'activité dithiol / disulfure est indispensable aux fonctions essentielles de la thiorédoxine. Ce résultat renforce l'hypothèse d'une implication de la thiorédoxine dans la protection contre le stress oxydatif et suggère également que cette protéine puisse réguler l'activité de l'A synthétase par un contrôle thiol-rédox, fonction déjà suspectée lors des premières études in vitro sur ses caractéristiques fonctionnelles.