Etablissement de cultures primaires de cellules de bivalves marins

Establishment of primary cell cultures from marine bivalves

• Auteur / Autrice : Françoise Le Marrec-Croq
• Direction : Germaine Dorange
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Océanologie biologique
• Date : Soutenance en 1995
• Etablissement(s) : Brest

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bivalves

Cultures cellulaires

Résumé

Notre etude se situe dans le cadre d'un programme de recherches mene en partenariat dans le but de mettre au point des cultures cellulaires chez les bivalves marins. Les travaux ont eu pour objectif l'etablissement de cultures primaires de cellules fonctionnelles de coquille st-jacques pecten maximus et d'huitre crassostrea gigas. Ils ont necessite la selection et l'optimisation d'un protocole de dissociation cellulaire et la mise en place d'un procede de decontamination microbienne de certains tissus pour eviter la presence de microorganismes parmi les suspensions cellulaires (branchies notamment). Les essais ont ete realises a partir de cur et de branchies de coquille st-jacques et a partir d'embryons d'huitre. La technique d'isolement des cellules a par la suite ete validee par les resultats des cultures realisees dans un milieu de base que nous avons defini. Certaines cellules adherent en effet systematiquement au support apres deux ou trois jours de culture. Deux types cellulaires sont differenciables, des cellules de type epithelial, peu nombreuses, et des cellules fibroblastiques, largement majoritaires. Les cellules fusiformes adherentes en culture, de type fibroblaste, ont ete caracterisees, dans le cas du cur, par microscopie electronique (presence de myofibrilles) et immunomarquage (reaction positive a l'anti-myosine et anti- tropomyosine) comme etant des myocytes. Cette conclusion est d'ailleurs corroboree par le fait qu'apres environ une semaine de culture, lorsque les cellules sont quasiment confluentes, elles reconstituent des formations plurinucleees de type myotubes qui se contractent spontanement in vitro. Les resultats des cultures, reproductibles dans le cas du cur de coquille st-jacques restent plus variables dans le cas des branchies et des cellules embryonnaires. Ces donnees nous ont donc conduit peu a peu a selectionner les cellules de cur pour les experimentations ulterieures. Diverses techniques analytiques (histoautoradiographie, comptage en scintillation, electrophorese et autoradiographie d'electrophorese, chromatographie sur couche mince et autoradiographie de chromatographie sur couche mince), mises en uvre a differents temps de culture, apres incubation des cellules en presence de precurseurs marques ont montre que les cellules de cur en culture dans le milieu de base neosynthetisent des proteines, de l'adn et des lipides pendant au moins 20 jours (c'est aussi le cas des branchies). Ces activites de biosynthese peuvent d'ailleurs etre stimulees par addition au milieu de base de certains facteurs d'origine marine notamment et des lipides en particulier ce qui prouve que le milieu de culture peut etre encore ameliore. Un protocole de cryopreservation des cellules de cur a pu etre mis au point, permettant d'obtenir des cultures a partir des cellules decongelees. L'activite de biosynthese de ces cellules en culture, evaluee apres sept jours, apparait equivalente, au moins, a celle des cellules temoins non congelees et le profil des proteines et des lipides neosynthetises par les cellules en culture apres congelation-decongelation est comparable a celui obtenu pour les cellules fraiches. De plus, comme pour les cellules non congelees, une differenciation terminale des myoblastes en myotubes est observee en culture. A titre preliminaire, pour une etude de faisabilite, ces modeles experimentaux ont aussi ete utilises comme bioessais pour des tests de cytotoxicite aigue (effet de sels de metaux lourds) et de genotoxicite (effet d'un produit mutagene de reference, l'aflatoxine b1), l'objectif etant de pouvoir proposer a terme, des biotests et biomarqueurs d'effets cytotoxique et genotoxique de xenobiotiques presents dans le milieu marin, completant ainsi la panoplie des tests deja disponibles pour la surveillance de la qualite de l'eau de mer (algues, bacteries, embryons). En conclusion, les donnees acquises au cours de ce travail et les techniques analytiques mises au point ont permis pour la premiere fois: - d'etablir des cultures primaires de cellules de cur de coquille st-jacques dont l'activite de biosynthese a ete verifiee avec rigueur au cours du temps par l'etude de certaines fonctions du metabolisme de base (en l'absence de biomarqueurs specifiques connus), - de congeler des cellules de cur de coquille st-jacques permettant, apres decongelation, d'obtenir des cultures dont l'activite de biosynthese in vitro est conservee. Ces resultats, qui ouvrent sur de larges perspectives vont, en outre, faciliter la mise en place de nouveaux modeles cellulaires chez des invertebres marins