Recherche Avancée

Thèse soutenue

Contribution à l'étude de la régénération et de la transformation par agrobactéries chez la Jusquiame noire (Hyoscyamus niger L. )

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Auteur / Autrice : Shanjun Tu
Direction : Brigitte S. Sangwan-Norreel
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biotechnologie Végétale
Date : Soutenance en 1995
Etablissement(s) : Amiens

Résumé

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La Jusquiame noire est une plante médicinale, productrice d'alcaloïdes tropaniques, chez laquelle aucune technique de régénération de plante transgénique n'existe. Notre travail a consisté à mettre au point une telle technique. Dans un premier temps, nous avons testé différentes voies pouvant conduire à la néoformation d'organes in vitro, puis de plantes : 1) L'androgenèse permet, dans certaines conditions la production de plantes androgénétiques. Ces plantes sont à l'origine d'explants à forte capacité organogène. Nous les avons exploitées pour mettre en place un système efficace de régénération. 2) A partir d'embryons zygotiques, issus des graines de Jusquiame noire, nous avons initié un second système de régénération, via l'embryogenèse somatique. Une fréquence maximale (40%) d'embryogenèse somatique et de régénération a été obtenue sur un milieu de base MS contenant 20 g/l de saccharose, 1 mg/l d'ana, 2 g/l de mi et 0,5 g/l de mes. Afin de comprendre les processus mis en jeu, des profils protéiques ont été étudiés au cours de l'embryogenèse somatique en comparant avec des embryons zygotiques et des cals. Divers explants de Jusquiame noire ont été inoculés par différentes souches désarmées d'Agrobacterium tumefaciens, portant les gènes GUS et NPTII. La fréquence maximale d'obtention de cals transgéniques, pour tous les explants testés, a été de plus de 30%. La régénération de bourgeons transgéniques n'a pu être obtenue qu'à partir de tissus néoformés sur les hypocotyles de plantules dérivées d'embryons polliniques. L'état transgénique de plantes produites a été confirmé par des tests histochimiques et fluorométrique GUS, des tests de ''recallusing'', des analyses moléculaires par PCR et Southern. Les fréquences d'expression GUS transitoire et de formation de cals sont influencées par de nombreux facteurs (origine de l'explant, période de coculture et de préculture, type de vecteurs utilisés, température de coculture, composés phénoliques et différents milieux). Des plantes transgéniques ont ainsi été produites. Cependant, de par leur origine androgénétique, ces plantes étaient haploïdes et stériles. A l'aide de deux souches d'Agrobacterium rhizogenes, des racines transgéniques ont aussi été initiées. La fréquence de formation de racines chevelues a été comparée en utilisant deux méthodes d'infection. Les contenus en alcaloïdes tropaniques des racines issues, soit de plantes transformées par Agrobacterium Tumefaciens, soit d'Agrobacterium rhizogenes, ont été analysés par HPLC et TLC. Les racines des plantes transformées par Agrobacterium tumefaciens semblent contenir de nouveaux alcaloïdes. La technique de transformation/régénération mise au point, pourra être exploitée pour transférer des gènes d'intérêt chez la Jusquiame. Il reste, en particulier, à doubler les chromosomes des plantes transgéniques, pour les rendre fertiles, et à identifier les alcaloïdes nouveaux