Les enzymes mutants y254l et d282n du site actif du flavocytochrome b#2 de saccharomyces cerevisiae difficultes de repliement dans escherichia coli role de la tyrosine 254 dans la fixation des ligands et la catalyse influence de l'aspartate 282 sur le pka de l'histidine catalytique

The mutant enzymes y254l and d282n of the active-site of flavocytochrome b#2 from saccharomyces cerevisiae difficulties of folding in escherichia coli the role of tyrosine 254 in ligand fixation and catalysis the influence of aspartate 282 on the pka

• Auteur / Autrice : MURIEL GONDRY
• Direction : Florence Lederer
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1994
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

Le flavocytochrome b#2 de saccharomyces cerevisiae appartient a la famille des -hydroxyacide deshydrogenases a groupement prosthetique flavinique. Il catalyse l'oxydation du l-lactate en pyruvate grace a une chaine de transfert electronique dont les maillons sont successivement le fmn, l'heme b#2 et le cytochrome c. Les donnees structurales combinees aux connaissances etablies par de nombreuses etudes en solution ont permis d'attribuer un role aux divers residus du site actif et de proposer un modele catalytique s'appuyant sur la formation d'un intermediaire carbanionique. L'enzyme sauvage et les proteines mutantes deja etudiees (y143f, y254f) sont exprimes dans escherichia coli avec un rapport stchiometrique unitaire du fmn par rapport a l'heme. Le premier chapitre est consacre a l'etude preliminaire, menee en parallele, des deux proteines mutantes car elles possedent des proprietes communes, a savoir un comportement chromatographique particulier et un manque partiel de flavine, qui les differencient de l'enzyme sauvage et des enzymes mutants deja etudies. Ce manque de groupement prosthetique flavinique proviendrait d'un manque de coordination entre l'insertion de la flavine et le repliement proteique dans escherichia coli. La mise au point d'un nouveau protocole de purification et la separation des formes holoenzymes et deflavoenzymes sont donc presentees. De plus, la caracterisation structurale des deux apohemoproteines montre que ces enzymes conservent une structure en tonneau #8b#8 mais subissent quand meme une modification les empechant d'etre reconstitues avec du fmn. Le deuxieme chapitre a pour but d'elucider le role de la tyrosine 254 du site actif en caracterisant la proteine y254l et en completant l'etude publiee de l'enzyme y254f. Cette analyse comparative confirme l'importance de la tyrosine 254 dans la stabilisation de l'etat de transition et montre que ce residu n'intervient pas dans la formation du complexe de michaelis ; la contribution de la tyrosine 254 a la fixation de differents ligands est egalement mise en evidence mais certains resultats sont difficilement interpretables avec la structure fixe du site actif du flavocytochrome b#2 sauvage. Nous disposons de plusieurs arguments pour penser qu'une region desordonnee dans la structure cristallographique pourrait jouer le role d'une boucle flexible interagissant avec le site actif de l'enzyme durant la fixation des ligands. Le troisieme chapitre presente la caracterisation de la proteine d282n. Nous avons pu, d'une part, confirmer que l'aspartate 282 n'est pas implique dans la formation du complexe de michaelis et, d'autre part, mettre en evidence sa fonction stabilisatrice de l'etat de transition. La valeur du pka de la base catalytique, l'histidine 373, du flavocytochrome b#2 sauvage oxyde subit une augmentation dans l'enzyme reduit. Ce deplacement de la valeur du pka pourrait trouver son origine dans l'interaction electrostatique engagee entre l'aspartate 282 et l'histidine 373. L'etude de la proteine d282n, dans laquelle cette stabilisation electrostatique ne peut pas s'etablir, montre que la valeur du pka de la base catalytique est diminuee de 1,4 unite ph