Role de l'histidine 373, base catalytique du flavocytochrome b#2 : changement de son pk#a dans l'enzyme reduit. passage d'un mecanisme par formation d'un carbanion a un mecanisme par transfert d'hydrure

The play of histidine 373, catalytic base of flavocytochrome b#2 : change on the pka in the reduced enzyme. alteration from carbanion mechanism to a hydride mechanism

• Auteur / Autrice : ALEXIS BALME
• Direction : Florence Lederer
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1994
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

Les alpha-hydroxy acides oxydases dependantes du fmn, catalysent la deshydrogenation des substrats par un mecanisme ou la premiere etape est l'arrachement du proton alpha du substrat, engendrant ainsi un carbanion. Pour le flavocytochrome b#2, il a ete montre que ce proton dans l'enzyme reduit est echange lentement avec le solvant urban & lederer, 1985. Ceci suggere un pk#a deplace de l'histidine catalytique de l'enzyme reduit libre. L'etude de l'influence d'un reseau de molecules d'eau, identifie par la structure cristallographique du site actif dans l'enzyme reduit, par l'emploi de mutant y254f et le domaine flavodeshydrogenase recombinant du flavocytochrome b#2 a permis de demontrer que ce reseau n'est pas le facteur principal de la faible vitesse d'echange du proton avec le solvant de l'histidine 373 grace aux experiences de transfert intermoleculaire de tritium balme & lederer, 1994. Il en ressort que d'autres interactions electrostatiques pourraient contribuer a la stabilisation de l'histidine 373 protonee: interactions paire d'ions aspartate 282-histidine 373, noyaux imidazolium et flavine anionique dans des plans paralleles. Dans l'etude de l'interaction du 5-deazafmn avec le deflavocytochrome b#2, l'observation des changements de reactivite du 5-deazaflavocytochrome b#2 par rapport au flavocytochrome b#2 dans des reactions caracteristiques du mecanisme par formation de carbanion peut etre interpretee comme une modification du mecanisme. Le 5-deazaflavocytochrome b#2 n'utilise plus le mecanisme par formation de carbanion mais un mecanisme par transfert d'hydrure: dans la reaction de transhydrogenation, le transfert intermoleculaire de tritium est de 100% sans echange avec le solvant ; la reaction d'elimination d'halogenure avec le bromopyruvate n'est plus effective avec le 5-deazaflavocytochrome b#2. Dans le mecanisme par transfert d'hydrure, le role de l'histidine 373 comme base catalytique demeure mais elle arrache le proton du groupement hydroxyle du substrat