Analyse du role de l'environnement d'oxydoreduction des cytochromes p450 produits chez la levure et identification des transporteurs endogenes

Analysis of the role of redox environment in cytochrome p450 activities expressed in yeast and identification of endogeneous components

• Auteur / Autrice : Gilles Truan
• Direction : Denis Pompon
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1994
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

Les cytochromes p450 (p450s) sont des monooxygenases impliquees, chez les mammiferes, dans le metabolisme et la degradation des medicaments, polluants, etc. Deux donneurs d'electrons sont associes aux p450s: la p450 reductase et le cytochrome b#5. L'expression heterologue d'adnc codant pour des p450s dans la levure s. Cerevisiae permet de produire des enzymes fonctionnelles mais dont les activites specifiques sont faibles. Nous avons construit des souches de levure surexprimant independamment ou simultanement la p450 reductase de levure et le cytochrome b#5 humain. Le croisement entre les souches modifiees permet d'obtenir des environnements d'oxydoreduction variables. La production de p450s de mammiferes dans ces souches a permis d'analyser le role des differents partenaires d'oxydoreduction dans l'activite specifique des p450s. Nous avons montre que les p450s 1a1 et 3a4 ont des comportements differents vis-a-vis des donneurs d'electrons. Le role de la p450 reductase par rapport au cytochrome b#5 est discute. En parallele, l'analyse des constituants endogenes du systeme de monooxygenase chez la levure a ete realisee grace a l'etude du mecanisme d'action d'une drogue antifongique: le ketoconazole. La cible de cet antifongique est le p450 51a1 qui est responsable de la demethylation en c14 du lanosterol. Cette etape est essentielle dans la biosynthese de l'ergosterol qui est le sterol majoritaire chez la levure. Les souches deficients en p450 reductase sont hypersensibles au ketoconazole. La recherche de suppresseurs de ce phenotype nous a permis d'isoler, cloner et sequencer le gene codant pour le cytochrome b#5 de levure. Lorsqu'il est surexprime, il retablit partiellement le niveau de resistance au ketoconazole observe dans les souches sauvages. Nous avons etabli que la suppression de l'hypersensibilite au ketoconazole par le cytochrome b#5 est sans doute indirecte et agit probablement sur une etape ulterieure a la demethylation du lanosterol par le p450 51a1