Diversite des microtubules chez la paramecie : caracterisation d'une collection d'anticorps monoclonaux diriges contre des epitopes sequentiels et post-traductionnels de la tubuline

Microtubule diversity in paramecium: characterization of a library of monoclonal antibodies directed against sequential and post-translational epitopes of tubulin

• Auteur / Autrice : ANNE-MARIE CALLEN-TANAY
• Direction : André Adoutte
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1994
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

La paramecie est un cilie qui presente une grande diversite de reseaux microtubulaires. Ces reseaux participent a l'architecture cytosquelettique et interviennent dans de nombreuses fonctions cellulaires. On avait etabli au cours des dix dernieres annees qu'a la diversite structurale et fonctionnelle des microtubules correspondait une certaine diversite biochimique de la tubuline, constituant majeur des microtubules. Le but de notre etude etait de mieux caracteriser cette diversite biochimique de la tubuline, en isolant une collection aussi large que possible d'anticorps distinguant diverses formes de cette proteine. Nous avons donc recherche des anticorps monoclonaux, apres immunisation de souris avec de la tubuline de cilies. Pour augmenter la diversite de la reponse immunitaire, nous avons fait varier l'origine et le mode de presentation de l'antigene ainsi que le schema d'immunisation des souris. Dix-huit de ces anticorps sont decrits dans ce memoire. Ils ont ete caracterises comme etant diriges contre des sequences primaires ou contre des modifications post-traductionnelles de la tubuline, en fonction de leur reactivite avec de la tubuline exprimee chez e. Coli (presumee non modifiee) ainsi que par des criteres immunocytochimiques. Leurs epitopes ont ete recherches sur les sous-unites alpha et beta de tubuline axonemale ou cytoplasmique, par immunotransfert, puis localisees plus precisement par cartographie peptidique apres action de la protease v8 sur les deux sous-unites de la molecule, ainsi que par l'utilisation du test de reactivite sur portion de tubuline clonee. Leur specificite, restreinte aux cilies ou elargie aux metazoaires, a ete testee par immunotransfert avec de la tubuline de cerveau de porc et par immunofluorescence sur cellules entieres 3t3 et ptk2. Une grande diversite d'anticorps a ete obtenue. Outre huit anticorps anti-sequences, dont les epitopes ont ete finement localises, nous avons obtenu des anticorps diriges contre quatre modifications post-traductionnelles. Nous les avons utilises en immunocytochimie et en microscopie confocale sur cellules entieres de paramecie. Sept reseaux microtubulaires dans les cellules en interphase et quatre autres dans les cellules en division ont ainsi ete decores differemment par l'ensemble de nos anticorps; leurs caracteristiques biochimiques sont donc differentes. La morphogenese de ces reseaux a ete suivie au cours de la division et nous avons pu en deduire la cinetique de mise en place des modifications. L'une de ces modifications post-traductionnelles a deja ete decrite par piperno; c'est une acetylation d'un residu lysine situe dans la partie n-terminale de la sous-unite alpha de la molecule. Les trois autres modifications sont en cours de caracterisation et affectent l'extremite c-terminale des sous-unites alpha et beta de la tubuline. Il semble bien que l'une d'elles soit d'un type nouveau car sa cinetique de mise en place et sa restriction a des categories de microtubules bien particuliers la distinguent de l'ensemble des autres modifications. Le role de ces modifications post-traductionnelles est discute en tant que systeme d'identification d'une stabilisation precedemment etablie et, par la, de transmission de l'information structurale lors de la genese de nouvelles polarites