Etude de l'hydroxyacide oxydase du rein de rat : clonage de l'adnc de deux isoenzymes, expression des deux proteines dans escherichia coli, comparaison de leurs proprietes physico-chimiques et cinetiques

The study of rat kidney hydroxy acid oxidase : cdna cloning of two isoenzymes. expression of these two proteins in escherichia coli and comparison of their physico-chemical and kinetic properties

• Auteur / Autrice : Ahmed Belmouden
• Direction : Florence Lederer
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1994
• Etablissement(s) : Paris 6

Résumé

Le propos de cette these est la construction d'un systeme d'expression de l'hydroxy acide oxydase (hao) du rein de rat dans escherichia coli, ceci afin d'etudier les relations structure-fonction de l'enzyme et de la comparer aux autres membres de sa famille. L'adn complementaire de cette enzyme (hao) a ete clone par la methode d'amplification enzymatique en s'aidant de la sequence en acides amines determinee precedemment dans le laboratoire. Deux types d'adn complementaire ont ete mis en evidence ; ils different par l'insertion de trois codons (vrk). L'analyse par transfert de northern a montre que l'arn messager de la hao est exprime specifiquement dans le rein de rat. L'isoenzyme hao-b1 a ete produite chez e. Coli, sous forme d'un hybride avec la glutathione s-transferase. Une caracterisation enzymatique et physico-chimique a montre que la hao a conservee les principales proprietes de l 'enzyme libre dans l'hybride. L'analyse des sequences n-hao-b2 (avec insertion) represente 10 a 15% du total des deux isoformes. La hao a ensuite ete exprimee sous une forme native par l'intermediaire du vecteur pl-hao. L'expression de la hao a partir de ce vecteur est dependante de la composition du milieu de culture et de genotype de la souche d'e. Coli utilisee comme hote. Dans les conditions optimales, la hao represente 20% des proteines bacteriennes solubles. La hao a ete purifiee en utilisant deux etapes chromatographiques. La caracterisation physico-chimique et cinetique des deux isoenzymes recombinantes a montre que l'isoenzyme hao-b1 est identique a l'enzyme purifiee a partir des reins de rat, et qu'il existe certaines differences entre les deux isoenzymes hao-b1 et hao-b2, pour le pka du n3 de la flavine, l'intensite de la bande a 270 nm dans le spectre cd, le parametre kcat du l-mandelate, ou la sensibilite a certains inhibiteurs (trans-cinnamate, oxalate et sulfite). Ces differences sont dues a l'insertion des trois acides amines dans la hao-b2 au niveau d'une boucle mobile qui aurait un role dans la catalyse