Rôle de l'histidine dans la reconnaissance des protéines : étude impliquant l'histidine dans des polymères synthétiques et dans des polymères protéiques

Role of histidine in protein recognition : histidine in synthetic polymers and histidine in proteins

• Auteur / Autrice : Karsten Haupt
• Direction : Mookambeswaran A. Vijayalakshmi
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génie enzymatique, bioconversion et microbiologie
• Date : Soutenance en 1994
• Etablissement(s) : Compiègne
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences pour l'ingénieur (Compiègne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Chromatographie d'affinité

Polymères

Impression moléculaire

Immunoglobuline G

Membranes (biologie)

Ligands

Histidine

Résumé

La reconnaissance biologique constitue la base de la plupart des réactions biologiques spécifiques comme la réaction d'un anticorps avec son antigène, celle d'une hormone avec son récepteur etc. Des efforts considérables ont été entrepris afin de développer des systèmes synthétiques capables de reconnaître une molécule donnée. Les ligands pseudobioséecifiques utilisés en chromatographie d'affinité constituent l'un de ces systèmes d'affinité de novo. L'acide aminé histidine qui joue souvent un rôle important dans la reconnaissance biologique a été aussi utilisée comme ligand d'affinité pseudobiospécifiques pour la purification de protéines. Nous avons utilisé l'histidine comme ligand immobilisé sur le Sépharose® pour la purification de la catéchol-2,3-dioxygénase de Pseudomonas putida. Cette enzyme a pu être purifiée en une seule étape à partir d'un extrait brut bactérien. Des études thermodynamiques ont révélées que l'adsorption de la protéine dépend des groupements fonctionnels de l'histidine restant libres après immobilisation du ligand. Avec le carboxyhexyle histamine comme ligand, l'adsorption de l'enzyme était favorisée par l'entropie, tandis qu'avec carboxyhexyle histidine, l'enthalpie était déterminante. Nous avons également utilisé l'histidine couplée à une membrane de PEVA de fibres creuses pour la purification d'immunoglobulines G à partir du sérum humain. La comparaison de ce support d'affinité membranaire au support base sur le Sépharose® a montré l'influence du matériel de support sur l'adsorption. La meilleure adsorption sur le support membranaire a été obtenue en présence des ions de tampons zwitterioniques qui ont permis de séparer la totalité de la fraction IgG du sérum. L'utilisation d'autres tampons à permis l'adsorption sélective des IgGl et des IgG3 ainsi des IgG avec des points isoélectriques déterminés. Une étude thermodynamique a montré que la contribution des différentes forces moléculaires dirigeant l'adsorption des IgG dépend largement de la température. L'histidine a aussi été couplée à la silice afin de développer un système analytique d'affinité basé sur l'HPLC pour l'analyse des igG. Dans la dernière partie de notre travail nous avons essayé d'incorporer l'histidine et un autre ligand pseudobiospécifiques, un chélate de cuivre, dans des sites d'adsorption crées par voie chimique en utilisant la méthode de l'empreinte moléculaire dans un polymère synthétique. Les igG et la ribonucléase A ont servi comme protéines modèles.