Caractérisation d'une nouvelle adényl-cyclase de cerveau de rat : identification d'une nouvelle protéine spécifique du système nerveux central

Characterization of a new rat brain adenylyl-cyclase. Identification of a new protein specific of the central nervous system

• Auteur / Autrice : Francis Castets
• Direction : Ariane Monneron
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et microbiologie
• Date : Soutenance en 1994
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 1

Mots clés

Mots clés contrôlés

ATP

Clonage moléculaire

Calmoduline

Calciprotéines

Marquage par photoaffinité

Adénylate-cyclase

Transduction du signal cellulaire

Synapses

Rats de laboratoire

Résumé

Nous avons caracterise, dans des synapses de cerveau de rat, une activite adenyl-cyclase d'un type nouveau qui a une constante catalytique extremement elevee. Un marquage par photoaffinite des fractions purifiees d'adenyl-cyclase avec des derives azido de l'atp et de l'ampc, revele qu'une proteine de 110 kda est capable de lier specifiquement ces sondes. L'accumulation d'une grande quantite de la proteine purifiee a permis son microsequencage (moins de 100 picomoles obtenues a partir d'un millier de cerveaux de rat). Les sequences des dix peptides obtenus par hydrolyse enzymatique de la proteine de 110 kda est absente des banques de donnees. Nous avons obtenu par rt-pcr un fragment d'adnc de 0,8 kb specifique des oligonucleotides deduits de certains de ces peptides. En utilisant ce fragment d'adn comme sonde, nous avons isole d'une banque d'adnc de cerveaux de rat quatorze clones hybridant avec cette sonde. Le sequencage de ces clones nous a permis de definir une sequence continue de 3,6 kb contenant un cadre ouvert de lecture codant une proteine de 846 acides amines appelee naci. Sa sequence est absente des banques de donnees, et contient cinq des dix peptides obtenus lors du microsequencage de la proteine de 110kda. Elle possede a son extremite c-terminale une sequence consensus de farnesylation. Des northern-blots realises sur l'arnm de differents tissus font apparaitre quatre transcrits specifiques de nac i, presents exclusivement au niveau du systeme nerveux central. Nac i a ete exprimee sous forme soluble dans e. Coli ce qui nous a permis de montrer qu'elle lie specifiquement le complexe ca#+#+/calmoduline. La surexpression dans les bacteries d'une proteine de fusion contenant une partie de nac i a permis d'obtenir des anticorps polyclonaux reconnaissant nac i en immunoblot. Sa surexpression dans des cellules de mammifere (cos-1 et ng 108-15) a permis de montrer que ces anticorps immunoprecipitent notre proteine. Je n'ai pas encore eu le temps de preciser la fonction de nac i, mais les proprietes de cette nouvelle proteine cerebrale suggerent fortement qu'elle soit impliquee dans les phenomenes de transduction des signaux