Recherche Avancée

Thèse soutenue

Contribution à l'étude du système de transport des dicarboxylates des mitochondries; purification, caractérisation

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Auteur / Autrice : Jamila Benba
Direction : Bernard Foucher
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
Date : Soutenance en 1993
Etablissement(s) : Rouen

Résumé

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Le travail presenté dans ce mémoire a été entrepris dans le but de purifier et de caractériser le transporteur des dicarboxylates des mitochondries, qui catalyse l'échange un contre un des dicarboxylates entre eux (malate, malonate, succinate) ou contre le phosphate. Cette étude a été effectuée simultanément sur les mitochondries de foie de rat et sur les mitochondries d'une souche de levure: Saccharomyces cerevisiae. Les mitochondries de levure ont été solubilisées par le Triton X-100 et l'extrait a été chromatographié sur hydroxyapatite. Le filtrat, traité par électrophorèse en milieu dénaturant, a révélé par coloration à l'argent la présence d'environ 5 protéines de Mr compris entre 28000 et 35000. Après reconstitution de l'activité de transport dans des liposomes, un accroissement de 10 fois, de l'activité spécifique d'échange a été observé. Le passage des protéines du filtrat d'hydroxyapatite sur une colonne de malate deshydrogénase mitochondriale (EC 1. 1. 1. 37) immobilisée sur Sépharose, a conduit à la purification complète du transporteur. Cette protéine, purifiée à partir des deux types de mitochondries, possède toutes les propriétés caractéristiques du transporteur in situ et présente, en milieu dénaturant, un poids moléculaire de 28000. L'activité du transporteur purifié à partir des mitochondries de levure, reconstituée dans des liposomes, montre un Km pour le succinate de 2 mM et un Vmax de 1,5 lmol. Min-1. Mg-1 protéines tandis que l'activité spécifique augmente de 300 fois par rapport à l'extrait de départ. L'activité d'échange du transporteur reconstituée des deux types de mitochondries est inhibée par un réactif des groupements SH, le p-chloromercuriphénylsulfonate et par un réactif des acides aminés, le phosphate de pyridoxal, suggérant l'implication d'un ou plusieurs groupements SH et d'un ou plusieurs résidus lysine dans le mécanisme catalytique du transporteur. L'analyse de la composition en acides aminés de la protéine de transport des mitochondries de foie de rat indique qu'il s'agit d'une protéine hydrophobe, légèrement acide, avec la partie N-terminale bloquée