Clonage des gènes skp et firA de Pasteurella multocida chez Escherichia coli

• Auteur / Autrice : FABRICE MANOHA
• Direction : CHRISTIAN DELAMARCHE
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1993
• Etablissement(s) : Rennes 1

Résumé

Une banque genomique de p. Multocida a ete realisee et criblee avec un serum dirige contre une proteine majoritaire de la membrane externe de p. Multocida, la porine h de 37 kda. Un clone (e. Coli puca) a ete selectionne pour ses proprietes de marquage par les anticorps. E. Coli puca contient un fragment d'adn genomique de p. Multocida de 2,9 kpb. Il exprime un peptide de 25 kda (p25) localise dans le periplasme et reconnu par le serum anti-porine h. Des anticorps polyspecifiques diriges contre les composants des enveloppes de p. Multocida ont permis de montrer que l'insert exprime aussi un peptide de 28 kda (p28). Une construction genetique (e. Coli pucb) a permis de surproduire les antigenes p25 (6% des proteines de la fraction soluble) et p28 (20% des proteines membranaires). Une carte de restriction ainsi que des sous-clones ont ete realises pour localiser les genes correspondant a p25 et p28 et permettre le sequencage de l'adn et la construction de sondes nucleotidiques. Des experiences d'hybridation adn-adn ont montre que l'insert est un fragment d'adn continu de p. Multocida en exemplaire unique dans le genome. Le sequencage de l'insert de 2,9 kpb decrit dans cette these montre l'existence de 3 phases ouvertes de lecture codant pour des peptides de 42 kda, 21 kda et 36 kda. La comparaison de la sequence d'adn avec les sequences n-terminales des peptides p25 et p28 montre que p28 est le precurseur de p25 et que le gene se situe au niveau de la phase ouverte correspondant au peptide de 21 kda. Cette sequence d'adn est homologue des genes omph de s. Typhimurium et hlpa (=skp) de e. Coli. D'autre part, la phase ouverte de 36 kda possede des homologies importantes avec les genes ssc de s. Typhimurium et fira d'e. Coli qui sont impliques dans la transcription. A partir de plusieurs sondes d'adn marquees a la digoxigenine, nous avons etudie le polymorphisme de restriction sur 9 souches de p. Multocida. Les resultats nous ont permis de classer les souches de pasteurelles en 3 groupes