Identification et caracterisation des domaines de photomodulation de la malate deshydrogenase a nadp de sorgho par mutagenese dirigee

Identification and characterization of the light-regulatory domains of sorghum nadp-dependent malate dehydrogenase by site-directed mutagenesis

• Auteur / Autrice : EMMANUELLE ISSAKIDIS
• Direction : MYRESLAWA MIGNIAC-MASLOW
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1993
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

La malate deshydrogenase a nadp (mdh a nadp) est une enzyme chloroplastique activee a la lumiere par les thioredoxines. Les residus cysteine impliques dans le mecanisme de sa photomodulation ont ete recherches par une approche moleculaire. Tout d'abord, un systeme performant d'expression de l'adnc codant pour la mdh a nadp de sorgho a ete mis au point. Il permet d'obtenir en grande quantite une mdh a nadp recombinante dont les caracteristiques biochimiques sont identiques a celles de l'enzyme de plante. Les premieres experiences de mutagenese dirigee ont concerne les residus cysteine localises dans la partie n-terminale de la proteine. Les enzymes modifiees ont toujours besoin d'etre activees. Cependant, leur activation est beaucoup plus rapide que celle de la proteine sauvage. Leurs proprietes catalytiques restent pourtant inchangees. Ces resultats indiquant la necessite de reduire un deuxieme pont, des experiences complementaires de mutagenese dirigee ont cible les residus cysteine localises dans la partie c-terminale. Les proteines correspondantes necessitent un traitement d'activation pour atteindre une activite maximale, avec une cinetique comparable a celle de l'enzyme sauvage. Toutefois, elles presentent, a l'etat oxyde, une faible activite de base avec une affinite tres faible pour l'oxaloacetate. En cumulant les mutations des cysteines n- et c-terminales, une mdh a nadp dont l'activite n'est plus dependante de la reduction et dont les caracteristiques biochimiques sont celles de l'enzyme sauvage pleinement activee a ete produite. L'approche moleculaire a montre que deux ponts disulfures sont impliques dans le mecanisme d'activation de la mdh a nadp. En integrant l'ensemble des resultats de ce travail et les donnees structurales obtenues par modelisation, un modele pour le mecanisme d'activation par la lumiere de la mdh a nadp est propose