Purification et caracterisation d'une acyl-hydrolase lipolytique des feuilles de vigna unguiculata

• Auteur / Autrice : YAMINA SAHSAH
• Direction : ANH THU PHAMTHI
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1993
• Etablissement(s) : Paris 7

Résumé

Le but de ce travail est de purifier et caracteriser une enzyme degradant les lipides polaires a partir d'extraits solubles des feuilles de vigna unguiculata l. Cv. Epace-1. Les substrats utilises dans ce travail (mgdg, dgdg, pc, pg et tag) ont ete extraits et purifies a partir des feuilles de la meme plante. Le mgdg a ete utilise comme substrat dans les tests enzymatiques. Sa degradation par l'extrait enzymatique soluble a donne comme produits, des acides gras libres, montrant que l'enzyme impliquee dans cette degradation est une acyl-hydrolase lipolytique. Apres des tests prealables, nous avons mis au point une strategie de purification comportant une etape de precipitation au sulfate d'ammonium, suivie par des passages successifs sur les colonnes suivantes: gel filtration (sephadex g-25), echangeuse d'anions (q-sepharose fast flow), tamis moleculaire (sephacryl 300 hr), chromatofocalisation (mono p) et une derniere etape d'electrophorese. Ceci nous a permis d'obtenir l'enzyme pure (les deux dernieres etapes de la purification ont egalement permis la determination du pm et du pl de l'enzyme respectivement). L'electrophorese en sds-page montre que l'enzyme est composee de 2 sous-unites de 40 kd. Le pm est de 80 kd, son pl est de 5,1. Cette enzyme a un km de 14,9 nm pour le substrat mgdg. L'etude de la specificite de la proteine pour d'autres classes lipidiques a montre qu'elle agit sur le mgdg, dgdg, pc et pg avec une plus grande affinite pour les galactolipides. Les triacylglycerols ne sont pas deacyles par cette enzyme. L'activite de l'enzyme est stimulee en presence de ca#2#+. L'enzyme presente une resistance a l'inactivation par des hautes temperatures allant jusqu'a 70c pendant 10 min