La pullulanase de klebsiella oxytoca, modele d'etude du triage des lipoproteines et de la secretion chez les bacteries a gram negatif

• Auteur / Autrice : Isabelle Poquet
• Direction : Anthony Pugsley
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1993
• Etablissement(s) : Paris 7

Résumé

La pullulanase (pula) de klebsiella oxytoca est un enzyme amylolytique secrete et une lipoproteine (proteine modifiee de facon post-traductionnelle par des acides gras sur la cysteine en position +1 de la forme mature). Elle est le modele d'etude d'une famille particuliere de proteines secretees chez les bacteries a gram negatif. Leur mecanisme de secretion comprend deux etapes: la voie generale d'exportation des proteines pour franchir la membrane cytoplasmique, puis, pour franchir la membrane externe, un systeme relais compose des proteines de secretion specifiques (appelees pul dans le cas de pula). Par ailleurs, la pullulanase permet d'aborder l'etude du mecanisme de la localisation dans l'enveloppe des lipoproteines (ou mecanisme de triage). J'ai etudie les elements de pula - sequence primaire, modification post-traductionnelle. . . - qui lui permettent d'etre correctement secretee par un hote heterologue, escherichia coli, ou son systeme de secretion a ete reconstitue. I) d'abord, l'extremite n-terminale du precurseur de pula est essentielle pour l'etape precoce de traversee de la membrane cytoplasmique: c'est un peptide-signal fonctionnel. Cette etape, qui necessite aussi les proteines sec, est donc assuree par la voie generale d'exportation des proteines. Cela confirme que pula est secretee par la voie generale de secretion. Ii) ensuite, la modification de pula par les acides gras n'est pas absolument essentielle pour sa secretion, mais elle augmente son efficacite en cas de surproduction. Cette etude a permis de montrer que l'intermediaire de secretion (entre les deux etapes) est periplasmique. Iii) par ailleurs, en l'absence des proteines pul, le triage de pula dans l'enveloppe depend uniquement de la presence d'un aspartate en position +2 de la forme mature. Ce resultat confirme l'existence d'une competition entre les mecanismes de triage des lipoproteines et de secretion. Lors de cette etude, la determination de la localisation des proteines dans l'enveloppe a ete amelioree d'un point de vue technique. Iv) enfin, le signal de secretion de pula specifiquement reconnu par les proteines pul pourrait etre une structure tridimensionnelle plutot qu'une sequence d'acides amines contigus, comme le suggere l'effet de mutations au hasard dans son gene de structure pula