Construction et analyse d'un vecteur viral replicatif a partir d'un retrovirus infectant la lignee germinale femelle de la souris swr/j

Design and analysis a repplicating vector derived from a retrovirus that can infect the germ line of swr/j females

• Auteur / Autrice : Pascal Nouvel
• Direction : Hubert Condamine
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1993
• Etablissement(s) : Paris 7

Résumé

Un retrovirus leucemogene murin baptise sr3, correspondant au locus endogene emv-16/17 a ete clone et sequence. Il s'est revele capable d'induire l'acquisition de loci proviraux dans une fraction de la lignee germinale. L'alignement de la sequence du plasmide psr3 avec les sequences virales des loci emv-1 (porte par la souris c3h/he et balb/c) et emv-11 (porte par la souris akr/j) revele l'origine recente par infection de la lignee germinale de ces loci ecotropiques endogenes. Emv-11 est l'ancetre probable des insertions emv-1 et emv-16/17. Nous avons cherche a realiser un systeme de transgenese base sur les proprietes du virus clone. Un vecteur retroviral contenant le gene env. Et une lignee complementante exprimant les genes gag et pol ont ete realises. Le gene lacz a ete introduit dans le vecteur viral. La frequence d'inactivation du gene lacz au cours d'un evenement d'infection unique a ete determinee. Cette frequence est de l'ordre de 0. 5%. Nous avons ensuite examine la fidelite de l'expansion du vecteur dans des conditions replicatives. Le vecteur a ete introduit dans des cellules complementantes par transfection. Dix jours plus tard, 5-20% des cellules etaient colorables en bleu apres marquage histochimique. La proportion des cellules bleues n'augmentait pas par la suite. Les cellules refractaires au marquage se sont revelees porter une insertion provirale correspondant au vecteur initial delete du gene lacz, et etre protegees contre l'infection, vraisemblablement par un mecanisme d'interference. Le vecteur delete est apparu avoir un fort avantage replicatif sur le vecteur portant le gene lacz. Les profils de transcription suggerent que le gene lacz interfere avec l'expression des genes viraux. Afin de definir plus precisement le mecanisme implique dans la variation genetique des retrovirus au cours de la reverse-transcription, un systeme d'analyse in vitro a ete realise. Deux molecules d'arn portant des marqueurs phenotypiquement distinguables sont utilises comme matrice pour la reverse-transcription in vitro. Les produits de reverse-transcription constituent des plasmides qui peuvent etre utilises pour transformer e. Coli. Les deux matrices conduisent respectivement a des plasmides de genotype (amp. Lac-) et (kana, lac+). Les recombinants sont de genotype (amp lac+). Ils apparaissent bleus apres etalement sur un milieu contenant de l'ampicilline. Ce systeme devrait permettre l'analyse du mecanisme de la recombinaison retrovirale